發(fā)布時(shí)間：2018-12-05 16:02

【摘要】：背景 皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma,CTCL)是一組異質(zhì)性的T細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤,以成熟CD4+的記憶性輔助T淋巴細(xì)胞在皮膚的惡性克隆性增生為特征,約占皮膚淋巴瘤的2/3以上。目前認(rèn)為,CTCL在免疫學(xué)表型上屬Th2或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg),約50%~60%的CTCL表達(dá)IL-2R。早期CTCL治療效果一般較好,但對(duì)中晚期CTCL目前尚無(wú)有效的治療方法。隨著對(duì)抗腫瘤免疫機(jī)制和CTCL生物學(xué)特性的深入研究,具有特異靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫毒素可作為其有效治療方法的選擇。 免疫毒素是由毒素肽和靶向載體連接的具有靶向殺傷能力的融合蛋白,這種特異性靶向功能使之成為腫瘤靶向性治療的一種新選擇。利用基因工程技術(shù)進(jìn)行克隆重組并在大腸桿菌中高效表達(dá)的融合蛋白具有穩(wěn)定性好、組織滲透性高、免疫原性低、較強(qiáng)的腫瘤導(dǎo)向特異性和易于在細(xì)菌中大量制備等特點(diǎn),使免疫毒素的實(shí)際應(yīng)用成為可能。美國(guó)FDA已首次批準(zhǔn)由IL-2和白喉毒素融合構(gòu)建而成的免疫毒素藥物DAB389IL-2(denileukin diftitox)用于治療CD25+的復(fù)發(fā)性或頑固性CTCL,雖然臨床取得一定療效,但其對(duì)肝臟、心血管、造血系統(tǒng)等多系統(tǒng)損傷引起的嚴(yán)重副作用限制了它的廣泛應(yīng)用。分析其原因?yàn)?1、以全長(zhǎng)IL-2作為靶向載體,特異性不夠。IL-2R存在于許多細(xì)胞因子和正常細(xì)胞上(如靜止T細(xì)胞、NK細(xì)胞等),且晚期CTCL患者皮損主要表達(dá)與IL-2低親和力的IL-2Rα(CD25),因此不能高效引導(dǎo)毒素分子特異殺傷CTCL細(xì)胞。2、大多數(shù)人幼年曾接種白喉?xiàng)U菌疫苗,或者接觸過(guò)該病菌,因而體內(nèi)攜帶白喉毒素的預(yù)存抗體,使該毒素療效受到影響。因此針對(duì)特異性靶點(diǎn)、降低毒素的抗原性可以改進(jìn)免疫毒素,提高其療效。 核糖體失活蛋白(RIPs)是一類植物來(lái)源的通過(guò)作用于真核細(xì)胞中核糖體和裸露原核的核糖體核糖核酸(rRNA),從而抑制蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞毒蛋白,按其結(jié)構(gòu)不同可分為Ⅰ型和Ⅱ型,其中Ⅰ型RIP可直接用于制備免疫毒素。絲瓜素luffin a是最經(jīng)典和研究最早的I型RIP,在絲瓜素家族成員中其毒性最強(qiáng),九十年代初期已有將它與抗黑色素單克隆抗體化學(xué)偶聯(lián)來(lái)靶向殺傷黑色素瘤細(xì)胞的報(bào)道。 單鏈抗體(ScFv)是抗體重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)一段連接肽(linker)連接而成的一種小分子抗體,具有分子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、半衰期短、免疫原性低、制備流程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛用于基因工程技術(shù)制備免疫毒素時(shí)靶向載體的選擇。CD25單鏈抗體能特異性與表達(dá)CD25的腫瘤細(xì)胞結(jié)合,目前已有用CD25scFv作為靶向載體構(gòu)建的重組免疫毒素用于治療播散性霍杰金淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)研究�；谝陨侠碚摶A(chǔ),我們?cè)O(shè)想以絲瓜籽來(lái)源的I型核糖體失活蛋白α-luffin-KDEL作為毒素分子,CD25單鏈抗體(CD25scFv)作為靶向載體利用基因工程技術(shù)來(lái)構(gòu)建表達(dá)一種新的重組免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL,探討其體外靶向抗腫瘤活性,以期用于CD25+的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤的實(shí)驗(yàn)研究。 目的 利用基因重組技術(shù)將從絲瓜籽來(lái)源的α-luffin-KDEL作為毒素分子,CD25scFv作為靶向載體構(gòu)建、表達(dá)、純化出重組免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL,以皮膚T細(xì)胞淋巴瘤來(lái)源的高表達(dá)CD25的Hut-78細(xì)胞作為主要測(cè)試對(duì)象,并以具有相似T細(xì)胞生物學(xué)行為但相對(duì)低表達(dá)CD25的Jurkat細(xì)胞和基本不表達(dá)CD25的B細(xì)胞來(lái)源的Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞作為對(duì)照細(xì)胞,檢測(cè)CD25scFv-α-luffin-KDEL對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響,探討其體外靶向生物學(xué)活性。 方法 1.依據(jù)成熟肽α-luffin的基因序列(GenBank NO:X62371.1)分別設(shè)計(jì)帶有NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物,利用RT-PCR從未成熟絲瓜籽中克隆成熟肽α-luffin的cDNA和N端連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽KDEL序列的α-luffin-KDEL基因,分別克隆至表達(dá)載體pET28a(+),經(jīng)測(cè)序正確后,將之分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLysS,誘導(dǎo)表達(dá)、Ni~(2+)-NTA層析純化,并用His抗體鑒定后,將獲得純化后的重組蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL以不同濃度和不同時(shí)相點(diǎn)分別作用于JEG-3、HepG2和MCF-7腫瘤細(xì)胞,用CCK-8法檢測(cè)兩種重組蛋白分別對(duì)三種不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,經(jīng)SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行析因方差分析,比較重組蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL的體外抗腫瘤活性。 2.以pET32a-anti-CD25-PE38KDELmutant質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出帶有BglII和NcoI酶切位點(diǎn)的CD25scFv片段,構(gòu)建到表達(dá)載體pET32a(+),經(jīng)測(cè)序正確后,將pET32a- CD25scFv與已構(gòu)建好的pET28a-α-luffin-KDEL同時(shí)用NcoI和XhoI酶切后連接構(gòu)建pET32a-CD25scFv-α-luffin-KDEL,經(jīng)測(cè)序正確后,將之轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21DE3,誘導(dǎo)表達(dá)、Ni~(2+)-NTA層析純化、透析復(fù)性,并His抗體鑒定重組蛋白;流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hut-78、Jurkat和Raji細(xì)胞表面CD25分子的表達(dá)情況;將所獲得的重組融合蛋白CD25scFv-α-luffin-KDEL用CCK-8法檢測(cè)其對(duì)Hut-78、Jurkat和Raji細(xì)胞增殖的影響,用Annexin V-FITC / PI雙染法和PI法檢測(cè)其對(duì)凋亡及細(xì)胞周期的影響。 結(jié)果 1.(1)成功擴(kuò)增出成熟肽α-luffin的cDNA,經(jīng)查對(duì),與GenBank上登錄的編碼成熟肽α-luffin的cDNA序列有一個(gè)堿基的突變,但不影響其編碼的氨基酸序列。經(jīng)比對(duì),該成熟肽α-luffin與luffin a有96%的同源性。(2)成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-α-luffin及pET28a-α-luffin-KDEL,并在大腸桿菌BL21DE3plysS中獲得部分可溶性表達(dá),分子量28kDa左右,經(jīng)Ni~(2+)-NTA層析純化,western blot鑒定為所需目的蛋白α-luffin和α-luffin-KDEL。(3)CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示:兩種蛋白對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用均存在明顯的時(shí)間及劑量依賴性關(guān)系,且對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用存在明顯差異,即對(duì)JEG-3細(xì)胞增殖的抑制作用較強(qiáng),對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用較弱;在不同濃度和不同時(shí)相點(diǎn)比較兩個(gè)蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用,結(jié)果顯示α-luffin-KDEL對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用均顯著強(qiáng)于α-luffin。 2.(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-CD25scFv-α-luffin-KDEL,經(jīng)大腸桿菌BL21DE3誘導(dǎo)表達(dá)出包涵體形式的融合蛋白,分子量約80kDa左右,經(jīng)純化、復(fù)性、western blot鑒定,獲得所需目的蛋白CD25scFv-α-luffin-KDEL。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hut-78、Jurkat和Raji細(xì)胞表面CD25分子的表達(dá)分別為87.5%、26.9%和0.2%。(3)免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL對(duì)Hut-78、Jurkat和Raji細(xì)胞增殖影響的結(jié)果顯示:CD25scFv-α-luffin-KDEL對(duì)三種細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性;且對(duì)Hut-78細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)Jurkat和Raji細(xì)胞,對(duì)Jurkat和Raji細(xì)胞的抑制作用未表現(xiàn)出明顯差異;CD25scFv-α-luffin-KDEL對(duì)Hut-78和Jurkat細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于α-luffin-KDEL;作為對(duì)照的α-luffin-KDEL對(duì)三種細(xì)胞增殖的抑制作用未表現(xiàn)出明顯差異。凋亡和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示:CD25scFv-α-luffin-KDEL對(duì)Hut-78和Jurkat細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的促凋亡作用;且明顯減少Hut-78及Jurkat細(xì)胞的S期細(xì)胞數(shù)目,使細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G0/G1期和G2/M。 結(jié)論 本研究主要結(jié)論:1、從絲瓜籽中克隆表達(dá)的重組成熟肽α-luffin和在N端添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)肽的α-luffin-KDEL均具有體外殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,且α-luffin-KDEL的作用更強(qiáng)。2、利用基因工程技術(shù)以α-luffin-KDEL作為毒素分子,CD25scFv作為靶向載體構(gòu)建表達(dá)的重組免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出很好的靶向殺傷表達(dá)CD25腫瘤細(xì)胞的作用,其機(jī)制可能系通過(guò)靶向促凋亡作用和作用于間期中DNA的合成,從而抑制了靶向細(xì)胞的增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉樹雷;何威;王儒鵬;黎智;吳軍;趙云;胡小紅;;重組免疫毒素hIL2-Luffin P1對(duì)Hut-78細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J];重慶醫(yī)學(xué);2008年08期

2 王儒鵬,周麗娜,吳軍,賀偉峰,易紹萱,陳希偉,張小容;重組免疫毒素hIL-2-LuffinP1的構(gòu)建及表達(dá)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年09期

3 王儒鵬;何威;劉樹雷;賀偉峰;張小容;吳軍;;重組免疫毒素hIL-2-LuffinP1對(duì)淋巴細(xì)胞體外增殖的影響[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2008年03期

4 魏明卉,李英,劉征;核糖體失活蛋白及研究進(jìn)展[J];南都學(xué)壇;2001年06期

5 王儒鵬;何威;賀偉峰;張小容;劉樹雷;吳軍;;重組免疫毒素對(duì)同種小鼠皮膚移植排斥反應(yīng)的抑制作用[J];免疫學(xué)雜志;2008年03期

6 陳紅，華陵，，王悅，顏茂恭，董貽誠(chéng)，余明琨，姚啟智;單鏈核糖體失活蛋白的核糖核酸酶活性[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;1996年05期

7 嚴(yán)明,楊欣秀,李臻,平蓓芳,張祖?zhèn)?絲瓜籽核糖體失活蛋白luffin-b的基因克隆及表達(dá)[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);2001年02期

8 高聞達(dá)，曹惠婷，季瑞華，張祖?zhèn)?絲瓜籽中蛋白質(zhì)生物合成抑制蛋白的分離、純化及性質(zhì)研究[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);1994年03期

9 熊長(zhǎng)云,張祖?zhèn)?一組絲瓜籽小分子核糖體失活蛋白LuffinS的分離、純化和性質(zhì)[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);1998年02期

10 張茹平,熊長(zhǎng)云,嚴(yán)明,張祖?zhèn)?免疫毒素Luffin B-Ng76對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞的體外抑制作用[J];生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào);1998年06期

本文編號(hào)：2365274