【摘要】： 研究背景： 自體游離毛發(fā)移植術已成為臨床治療毛發(fā)缺損特別是雄激素性禿發(fā)最常用的手術方法,但存在許多問題,如供區(qū)不足、供區(qū)瘢痕、移植密度低,移植成活率低,明顯影響手術效果,毛囊組織工程的研究成為了解決這些問題的關鍵。毛囊中各類細胞的分離是整個毛囊組織工程研究的基礎,毛囊是由上皮成分(包括毛母質(zhì)、內(nèi)外根鞘)和真皮成分(包括毛乳頭、結(jié)締組織鞘)組成的,其中毛乳頭細胞是構(gòu)成毛乳頭的主要間質(zhì)細胞,它們是一簇特化的成纖維細胞。所有的毛乳頭細胞在外觀上都呈成纖維細胞樣,而且在含有小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛乳頭細胞有著聚集性生長的特性。隨著毛囊的周期性循環(huán),毛乳頭的形態(tài)也發(fā)生著周期性的改變。它在毛囊的生長發(fā)育形成及周期調(diào)控中起著重要的作用。因此建立毛乳頭細胞體外培養(yǎng)模型,對于詳盡地了解毛乳頭細胞體外培養(yǎng)生長特點,以及如何誘導毛囊的發(fā)生,具有重要的意義。毛囊中的上皮成分是毛發(fā)纖維產(chǎn)生的基礎,對于毛囊組織工程的構(gòu)建是必不可少的種子細胞,目前的實驗主要是以動物觸須毛囊和人頭皮毛囊為研究材料,分離毛囊中各類細胞。但目前對于這兩類細胞的分離方法也只適用于實驗室的少量制備,不適合于組織工程對細胞分離的大規(guī)模高效快速的要求。目前已經(jīng)成功建立了多種毛囊重建的實驗動物模型,但對于影響毛囊重建方向的因素還未見相關研究報道。 目的： (1)研究小鼠皮膚毛囊細胞的分離方法。 (2)研究表皮細胞、毛囊細胞、移植部位對毛囊重建的影響。 (3)研究可降解支架材料對毛囊重建的影響。 (4)研究毛囊重建方向的決定因素。 方法： (1)小鼠皮膚毛囊細胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法 取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置無菌培養(yǎng)皿中,安爾碘消毒3遍,PBS充分沖洗,轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中,剪下背部全層皮膚,平鋪于培養(yǎng)皿中,加入0.2% Dispase,充分浸沒組織塊,置37℃水浴消化2h,倒掉消化液,用鑷子小心提起全層皮膚平鋪于另一干燥的無菌培養(yǎng)皿中,真皮面朝上,把真皮從表皮上剝離,表皮行常規(guī)石蠟切片HE染色。PBS沖洗真皮,用剪刀修剪成小塊,取一小塊行常規(guī)石蠟切片HE染色,其余置離心管中,在37℃緩慢攪拌的條件下加入0.2%Ⅰ型膠原酶消化30分鐘,加入適量完全培養(yǎng)基稀釋消化液,充分振蕩,經(jīng)250μm篩網(wǎng)(60 TYLER MESH)過濾后收集濾液,150g離5分鐘,收集沉淀重懸于完全培養(yǎng)基,20g離心3分鐘,重復2次,沉淀再次重懸于適量完全培養(yǎng)基,加等量9% Ficoll。在15ml錐形離心管中加入5ml 9% Ficoll,再緩慢加入10ml上述制備的沉淀-Ficoll混懸液(約含8～10只乳鼠真皮消化物),40g離心5分鐘,去上清液。沉淀重懸于完全培養(yǎng)基,40g離心5分鐘,重復3次,收集沉淀加入適量0.2%Ⅰ型膠原酶置37℃水浴消化1h,用吸管間斷吹打,消化完畢,加PBS稀釋消化液,450g離心5分鐘,去消化液,再加入0.125%胰蛋白酶37℃水浴消化10分鐘,加入完全培養(yǎng)基,充分振蕩,經(jīng)25μm篩網(wǎng)(500 TYLER MESH)過濾后收集濾液,450g離心5分鐘,重復3次,收集細胞備用。調(diào)整細胞濃度為1×106個／ml,臺盼藍染色法檢測細胞存活率,行流式細胞儀檢測CD34、CD117表達。 細胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基,調(diào)整細胞濃度1×105個／ml。取1 ml細胞懸液接種于35mm培養(yǎng)皿(預先把清潔無菌的蓋玻片平鋪于皿底),置培養(yǎng)箱1h,去掉培養(yǎng)基,重新加入新鮮培養(yǎng)基置5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h更換一次培養(yǎng)液。細胞生長至80%融合時進行傳代培養(yǎng)。小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗)3次,加入適量0.125%胰蛋白酶,使消化液的量能蓋住細胞,倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若多數(shù)細胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮,細胞之間不再連接成片,棄去胰蛋白酶液,加入新鮮的培養(yǎng)液。用吸管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液,置10ml離心管中,500g離心5min,棄上清液,重復離心洗劑2次,棄去清液,加入2ml培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液,按1：2進行傳代培養(yǎng)。對原代培養(yǎng)細胞及傳代培養(yǎng)細胞按試劑盒操作說明行α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定。 (2)毛囊細胞注射移植方法 取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置無菌培養(yǎng)皿中,安爾碘消毒3遍,PBS充分沖洗,轉(zhuǎn)移至另一無菌培養(yǎng)皿中,剪下背部全層皮膚,平鋪于培養(yǎng)皿中,加入0.2% Dispase,充分浸沒組織塊,置37℃水浴消化2h,倒掉消化液,用鑷子小心提起全層皮膚平鋪于另一干燥的無菌培養(yǎng)皿中,真皮面朝上,把真皮從表皮上剝離備用。在含表皮的培養(yǎng)皿中加入適量0.125%胰蛋白酶室溫消化10分鐘,用吸管間斷吹打,使表皮細胞充分游離,加入適量完全培養(yǎng)基。消化液經(jīng)25μm篩網(wǎng)(500 TYLER MESH)過濾后收集濾液,450g離心5分鐘,重復3次,收集細胞備用。 取10mg Dil置離心管中,加入5ml DMSO,避光,37℃水浴,間斷振蕩至充分溶解,無菌過濾分裝至PCR反應管中,每管10μl,-20℃凍存。調(diào)整表皮細胞濃度為1×107個／ml,取1ml細胞懸液置離心管中,加入10μl DiI儲存液,吸管吹打混勻。置5%CO2培養(yǎng)箱中標記30分鐘。450g離心5分鐘,棄上清,重懸于完全培養(yǎng)基中,重復上述離心過程3次以去掉多余的熒光探針。重懸于完全培養(yǎng)基中備用。按同樣濃度對毛囊細胞行DiO標記。 取表皮細胞(1×107個)+毛囊細胞(1×107個)制成1ml細胞懸液,在裸鼠背部標記5個點,用1ml注射器行皮內(nèi)注射,形成一小水泡,按住進針點出針。每點注射0.1ml,每點注射細胞數(shù)目為1×106個。按同樣注射方法行表皮細胞(1×106個)、毛囊細胞(1×106個)、毛囊細胞(1×105個)、毛囊細胞(1×104個)、毛囊細胞(1×103個)、1代培養(yǎng)毛囊細胞(1×106個)、2代培養(yǎng)毛囊細胞(1×106個)、3代毛囊細胞(1×106個)、表皮細胞(1×106個)+大鼠足底成纖維細胞(1×106個)注射。3周后取材行冷凍切片熒光檢測和石蠟切片HE染色。 按上述同樣注射方法,行毛囊細胞(1×106個)皮內(nèi)注射,分別在在2d、4d、1周、3周、6周后取材行冷凍切片熒光檢測和石蠟切片HE染色。 毛囊細胞(1×107個)制成1ml細胞懸液,在裸鼠背部標記5個點,用20ml注射器針頭穿刺至筋膜,用移液器吸取0.1ml細胞懸液沿穿刺點平行插入皮下,把細胞注射在筋膜表面,每點注射0.1ml。3周后取材行冷凍切片熒光檢測和石蠟切片HE染色。。 (3)毛囊細胞與材料的復合移植方法 把Ⅰ型膠原海綿置無菌培養(yǎng)皿中,修剪成1×lcm大小。調(diào)整毛囊細胞濃度為1×107個／ml,每塊膠原海綿滴加0.1ml細胞懸液。取裸鼠3只,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在頭部和尾部分別切開長約1cm切口,深達筋膜,將膠原海綿置入皮下,縫合切口。4W取材行石蠟切片HE染色。 取PLGA微管,剪成長1.5cm小段,浸75%酒精消毒1h,PBS沖洗3遍,浸PBS過夜備用。取裸鼠3只,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml／100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在頭部和尾部分別切開長約0.5cm切口,深達筋膜,將PLGA微管插入皮下。調(diào)整毛囊細胞濃度為1×107個／ml,在每個微管中注入細胞懸液0.1ml�？p合切口。4w取材行石蠟切片HE染色。 Ⅰ型膠原海綿、PLGA微管直接裝臺鍍膜進行掃描。毛囊細胞與Ⅰ型膠原海綿復合培養(yǎng)1w后,棄培養(yǎng)液,加入PBS清洗3遍,經(jīng)固定、干燥行掃描電鏡檢測。 (4)毛囊細胞小室移植方法 毛囊細胞開放小室移植取5ml耐高溫的塑料離心管,去掉中央部分,在蓋子下端貼一層透明膠帶,固定后在膠帶中央扎數(shù)個小孔,高壓消毒備用。取5只裸鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在背部切除一加圓形皮膚,深達筋膜,直徑為離心管蓋直徑的一半。把制備好的離心管蓋子插入皮下,蓋子下端朝向皮膚表面,暴露于空氣中,把皮膚縫合在蓋子周邊固定,形成一個可以容納細胞懸液的開放小室。調(diào)整毛囊細胞濃度為1×107個／ml,在每個小室內(nèi)注入細胞懸液0.1ml。同時行單獨小室移植作為對照組。4w取材行石蠟切片HE染色和冷凍切片熒光檢測。 毛囊細胞封閉小室移植取5ml耐高溫的塑料離心管,去掉中央部分,高壓消毒備用。取5只裸鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在背部切開全層皮膚,切口長度為離心管蓋直徑的一半,深達筋膜,把制備好的離心管蓋子完全插入皮下,使皮膚完全覆蓋整個蓋子,切口縫合固定,形成一個可以容納細胞懸液的皮下封閉小室。調(diào)整毛囊細胞濃度為1×107個／ml,在每個小室內(nèi)注入細胞懸液0.1ml。4w取材行石蠟切片HE染色和冷凍切片熒光檢測。 結(jié)果： (1)小鼠皮膚毛囊細胞的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果 C57BL／6J乳鼠出生后3d皮膚毛囊大多已經(jīng)發(fā)育完整,5d時多數(shù)毛干已經(jīng)穿出皮膚表面。經(jīng)Dispase消化后,表皮極易從真皮上剝離,組織切片可見真皮含有大量毛囊,結(jié)構(gòu)完整,毛囊與周圍組織間隙變得疏松,真皮與表皮交界部位未見表皮成份殘留。真皮消化液經(jīng)過濾、低速離心、密度梯度離心后可收集大量毛囊及毛囊組織塊,經(jīng)膠原酶、胰蛋白酶消化后可獲得毛囊單細胞懸液,細胞存活率在85%以上。 流式細胞儀檢測表明,分離的毛囊細胞中含有2.5% CD34陽性細胞,8.3%CD117陽性細胞。原代培養(yǎng)細胞呈現(xiàn)自發(fā)聚集性生長特性,隨著傳代次數(shù)增加,聚集性生長特性逐漸消失。3代以后不再呈現(xiàn)聚集性生長特性。聚集性生長區(qū)細胞呈ALP陽性,周圍細胞有少量陽性表達,隨傳代次數(shù)增加ALP陽性細胞數(shù)逐漸減少,4代以后的細胞無ALP陽性表達。所有培養(yǎng)的細胞均呈α-SMA陽性,表達穩(wěn)定,不隨傳代次數(shù)增加而變化。 (2)毛囊細胞注射移植結(jié)果 表皮細胞皮內(nèi)注射移植組3周后所有注射點外觀稍隆起,形成一個內(nèi)含灰白色內(nèi)容物的囊,冷凍切片熒光檢測見皮內(nèi)少量紅色熒光,組織切片HE染色無可見的毛囊結(jié)構(gòu)。足底成纖維細胞皮內(nèi)注射移植組3周后所有注射點均無外觀可見的變化,冷凍切片熒光檢測見皮內(nèi)密集綠色熒光,組織切片HE染色無可見的毛囊結(jié)構(gòu)。表皮細胞+足底成纖維細胞皮內(nèi)注射移植組3周后所有注射點外觀稍隆起,形成一個內(nèi)含灰白色內(nèi)容物的囊,冷凍切片熒光檢測,見皮內(nèi)以綠色熒光為主,散在分布少量紅色熒光,組織切片HE染色無可見的毛囊結(jié)構(gòu)。 毛囊細胞皮內(nèi)注射移植后2d,組織切片HE染色見移植區(qū)形成一個皮內(nèi)囊,囊壁較厚,由大量長梭形成纖維樣細胞構(gòu)成,囊內(nèi)含有大量圓形、橢圓形細胞,核大、胞質(zhì)不明顯,囊內(nèi)同時可見大量均質(zhì)紅染無細胞成份。囊內(nèi)側(cè)壁見大量細胞密集排列,散在分布排列稀疏的細胞團,細胞外基質(zhì)明顯增多,中央見均質(zhì)紅染的角化物,局部可見腺樣細胞。冷凍切片熒光檢測見囊內(nèi)呈密集的綠色熒光,囊壁呈稀疏的散在分布的綠色熒光。移植后4d,注射部位輕微隆起,外表呈灰色,鏡下可見大量再生的毛囊,毛球部呈黑色,無明顯毛干。移植后1周,注射點均可見明顯隆起,外表呈現(xiàn)黑色,鏡下可見大量毛囊伴有明顯的黑色毛干,局部見密集分布的血管,管徑增粗。移植后3周注射部位形成一個含有灰白色內(nèi)容物的囊腫,鏡下可見密集的黑色毛發(fā),冷凍切片熒光檢測見明亮綠色熒光。整個組織塊行石蠟切片HE染色,見囊壁較薄,結(jié)構(gòu)完整,外壁為致密的纖維組織,有粗大的血管穿行,內(nèi)襯有類似表皮的角化上皮樣結(jié)構(gòu),囊內(nèi)含有大量均質(zhì)紅染無細胞成份,新生毛囊朝向中心,毛球部朝向外側(cè),有些毛囊周圍可見排列有序的腺樣細胞,類似皮脂腺樣結(jié)構(gòu)。移植后6周,見囊內(nèi)充滿大量毛干,鏡下可見大量脫落的杵狀毛干及處于生期的毛囊。 表皮細胞和毛囊細胞的復合皮內(nèi)注射移植后3周,注射部位形成一個含有灰白色內(nèi)容物的囊腫,鏡下可見密集的毛發(fā),石蠟切片HE染色結(jié)果同毛囊細胞單獨皮內(nèi)注射移植。冷凍切片熒光檢測,見囊內(nèi)容物以綠色熒光為主,散在分布少量紅色熒光。新生毛囊呈綠色熒光,毛乳頭部位最為明顯。 當毛囊細胞濃度1×106個／ml時,即每個注射點含細胞數(shù)1×105個,再生毛囊的數(shù)量急劇減少,當毛囊細胞濃度低于1×106個／ml時,注射部位只會形成一個灰白色囊腫,但無新生毛囊形成。經(jīng)快速貼壁培養(yǎng)的1代、2代、3代毛囊細胞細胞皮內(nèi)注射移植后均無新生毛囊形成。 毛囊細胞皮下注射移植3周后,見皮下散亂分布大小不等的灰白色囊腫,新生毛囊數(shù)量少,方向雜亂。 (3)毛囊細胞與材料的復合移植結(jié)果 掃描電鏡可見PLGA微管內(nèi)徑1.5mm,管壁厚lmm。管壁中含大量連通的微孔,直徑10-50um。Ⅰ型膠原海綿材料孔徑較粗,直徑100-500um,與毛囊細胞復合培養(yǎng)1w后可見有少量細胞貼壁生長。PLGA降解檢測表明,4w時開始出現(xiàn)材料降解,可見有血管長入。 毛囊細胞與Ⅰ型膠原海綿復合移植4w,組織取材行石蠟切片HE染色,可見少量新生毛囊結(jié)構(gòu)形成,毛干不明顯,方向雜亂,冷凍切片呈明亮綠色熒光。毛囊細胞與PLGA微管復合移植4w,見微管開始降解,管腔塌陷,表面有新生血管長入,但未見新生毛囊。 (4)毛囊細胞小室移植結(jié)果 小室單獨行開放創(chuàng)面移植1w,見創(chuàng)面收縮明顯,小室邊緣已經(jīng)開始脫離皮膚,去除小室后3w,見直徑1cm的圓形創(chuàng)面收縮至直徑2mm。在小室中加入毛囊細胞,開放創(chuàng)面移植后1w,見創(chuàng)面無明顯收縮,小室中央見淡紅色半透明組織形成,局部可見黑色沉積物。4w后小室周邊創(chuàng)面已愈合,創(chuàng)面無收縮,表面見大量新生黑色毛發(fā)垂直于皮膚表面生長。石蠟切片HE染色見皮膚結(jié)構(gòu)發(fā)育完整,表皮、真皮層次清晰,絕大多數(shù)毛囊均垂直于皮膚表面生長,毛囊上、中1／3交界處可見皮脂腺,但未見立毛肌結(jié)構(gòu)。冷凍切片熒光檢測,見毛發(fā)生長區(qū)的表皮及毛囊均呈明亮的綠色熒光,毛囊周圍的組織無明顯熒光。 毛囊細胞封閉小室移植4w,打開小室,底面可見新生毛囊平行于皮膚表面生長,方向排列雜亂,伴有大量新生血管。冷凍切片熒光檢測,見毛囊及周圍組織均呈明亮的綠色熒光。 結(jié)論 (1)本研究首次采用小鼠皮膚制備了毛囊單細胞懸液。其細胞成份主要為毛乳頭細胞,含有2.5% CD34陽性的毛囊干細胞,8.3%CD117陽性的黑色素細胞。 (2)本研究中所分離的毛囊細胞裸鼠皮內(nèi)注射能夠重新進行發(fā)育,形成大量結(jié)構(gòu)完整的正常毛囊和皮脂腺。這種毛囊的再生依賴于所移植細胞的密切接觸。 (3)Ⅰ型膠原海綿和PLGA微管不支持毛囊細胞的定向重建。 (4)毛囊的發(fā)育空間為再生毛囊的定向提供了可能性,而氣液界面則決定了最終新生毛囊的方向。毛囊細胞開放小室移植可以實現(xiàn)新生毛囊的正常體表分布,構(gòu)建結(jié)構(gòu)、功能完整的皮膚組織,與注射移植法相比,更具有臨床應用的前景。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R758.7

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本文編號：2351652