發(fā)布時(shí)間：2018-11-04 10:03

【摘要】：惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)是一種起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤,該病90%原發(fā)于皮膚,少數(shù)發(fā)生于皮膚以外的部位。MM的發(fā)病率和死亡率在全球均呈上升趨勢(shì),其中發(fā)病率更以每年4%的速度遞增,增長(zhǎng)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他惡性腫瘤。雖然MM的發(fā)病率僅占皮膚惡性腫瘤的3%左右,但死亡構(gòu)成比卻達(dá)到75%。早期MM經(jīng)擴(kuò)大切除術(shù)后90%以上可治愈,而一旦出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,則中位生存期一般不超過(guò)1年。本病5年生存率在發(fā)達(dá)國(guó)家較高,但發(fā)展中國(guó)家僅為40%。與歐美國(guó)家相比,我國(guó)MM發(fā)病率雖不高,但一般在初診時(shí)疾病多為晚期,預(yù)后極差。 目前MM的臨床常用治療手段有：手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療以及靶向治療等,這些常規(guī)治療方法對(duì)一部分患者是非常有效的,但其特定適應(yīng)癥和禁忌癥,以及伴隨的毒副反應(yīng)限制了其臨床使用,且臨床上經(jīng)常觀察到一些患者對(duì)以上常規(guī)治療的敏感性較差。目前針對(duì)無(wú)法手術(shù)的局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的治療仍然非常棘手,對(duì)于這類患者,臨床結(jié)果顯示現(xiàn)有的常規(guī)治療較少能提高其總生存率。因此,如何提高M(jìn)M的總體療效,研究新的,低毒高效的治療方式,仍然是臨床及基礎(chǔ)研究者們長(zhǎng)期研究的課題。 腫瘤電療是將電工技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療的一種創(chuàng)新性物理治療手段,隨著近年來(lái)生物電學(xué)研究的蓬勃發(fā)展,利用電場(chǎng)作為腫瘤的治療手段已顯示出良好的應(yīng)用前景。參數(shù)不同、性質(zhì)各異的各類電場(chǎng)已被廣泛試用于腫瘤治療,并且取得了良好的效果。比較成熟的治療腫瘤的電場(chǎng)類型是通過(guò)熱效應(yīng)殺滅腫瘤細(xì)胞的射頻或微波裝置。近年來(lái)關(guān)于單純利用電場(chǎng)非熱物理特性治療腫瘤的報(bào)道逐漸增多,其中最具有代表性的是中頻交變電場(chǎng)(intermediate-frequency alternating electricfield, IF-AEF)。一般認(rèn)為,低頻(1kHz)電場(chǎng)的主要效應(yīng)為刺激可興奮組織,常用于刺激骨組織生長(zhǎng)或促進(jìn)骨折愈合；高頻(MHz級(jí)以上)電場(chǎng)的電刺激作用基本消失而主要產(chǎn)生熱效應(yīng),在以往的研究中常被用于熱療或消融治療；而頻率在100kHz-1MHz的IF-AEF,長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為不會(huì)產(chǎn)生明顯的生物效應(yīng)。但近期有報(bào)道指出在一定條件下IF-AEF也可產(chǎn)生一定的抗腫瘤效應(yīng),之所以以往未能發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng),是由于其抗腫瘤效應(yīng)具有極強(qiáng)的頻率依賴性,對(duì)于特定的腫瘤細(xì)胞系,并非所有中頻范圍內(nèi)的IF-AEF都可對(duì)其增殖造成影響,而是只有特定頻率的IF-AEF才會(huì)明顯影響腫瘤細(xì)胞的增殖,而在偏離這個(gè)最佳頻率時(shí),其生物學(xué)效應(yīng)明顯減弱。腫瘤治療電場(chǎng)是以色列的一些研究者發(fā)現(xiàn)并命名的一種特殊IF-AEF,在低強(qiáng)度(2V/cm)、中頻(100-300kHz)條件下,可通過(guò)抗微管機(jī)制而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。作為一種新的治療腫瘤的物理手段,當(dāng)電場(chǎng)頻率被準(zhǔn)確地選定時(shí),這種IF-AEF已被證明對(duì)多種人類及嚙齒類動(dòng)物腫瘤細(xì)胞系的增殖有顯著抑制作用。由于既往研究發(fā)現(xiàn)不恰當(dāng)?shù)奶幚?刀割、激光和冷凍等)有可能誘發(fā)MM的迅速生長(zhǎng),所以關(guān)于電場(chǎng)等物理手段治療MM的研究較少。 侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最顯著的生物學(xué)特征,也是惡性腫瘤預(yù)后差,并導(dǎo)致患者死亡的主要原因。MM容易侵襲局部組織,進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此抑制MM的侵襲是該病治療的重要策略,也是臨床治療成敗的關(guān)鍵。近年來(lái)的一些研究也發(fā)現(xiàn)一些電場(chǎng)對(duì)腫瘤的侵襲能力有一定的影響,但關(guān)于IF-AEF對(duì)腫瘤侵襲能力的影響,目前尚不清楚。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞的凋亡異常密切相關(guān),而且有觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞凋亡抑制比細(xì)胞過(guò)度增殖所起的作用更為重要。已有許多研究表明MM與其他惡性腫瘤相比,其自發(fā)凋亡水平較低,且對(duì)一般化療藥物所誘導(dǎo)的凋亡敏感性較低。因此,抗腫瘤技術(shù)若能誘發(fā)MM細(xì)胞凋亡,則可抑制腫瘤生長(zhǎng)。維持腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)有賴于新生血管對(duì)其營(yíng)養(yǎng)與代謝的支持,沒有新生血管腫瘤將難以持續(xù)增殖,因?yàn)閮H靠周圍血管對(duì)腫瘤的彌散作用是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,腫瘤將只能處于休眠狀態(tài)甚至發(fā)生退化,而血管一旦長(zhǎng)入腫瘤組織中,腫瘤則呈現(xiàn)出快速生長(zhǎng)的狀態(tài)。因此靶向腫瘤血供的抗血管生成治療正成為腫瘤治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)�？寡苌芍委煹哪康牟皇侵苯託[瘤細(xì)胞,而是通過(guò)抑制并破壞腫瘤的血管支持網(wǎng)絡(luò),從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前的研究已經(jīng)顯示,性質(zhì)不同的電場(chǎng)對(duì)腫瘤新生血管的作用有著明顯的不同,有些電場(chǎng)可以抑制新生血管的形成,有些電場(chǎng)則可促進(jìn)新生血管的生長(zhǎng)。而既往尚無(wú)關(guān)于IF-AEF對(duì)腫瘤新生血管作用的研究。 電場(chǎng)的生物效應(yīng)及其作用機(jī)理是非常復(fù)雜的,同時(shí)電場(chǎng)對(duì)腫瘤的作用也受到多方面因素的制約,因此,對(duì)于IF-AEF抑制腫瘤的機(jī)制仍需進(jìn)一步的探索。本課題從不同生物層次觀察了IF-AEF對(duì)腫瘤細(xì)胞及組織的作用：首先通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察IF-AEF對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制及對(duì)其侵襲能力的影響；然后通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察IF-AEF對(duì)小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用并探討其可能的作用機(jī)制,從而進(jìn)一步闡明IF-AEF抑制MM的分子機(jī)制,可能為MM提供一種新的治療手段。 第一章中頻交變電場(chǎng)對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖及體外侵襲能力的影響 目的探討IF-AEF對(duì)體外培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞增殖及體外侵襲能力的影響。 方法惡性黑色素瘤B16F10細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。體外實(shí)驗(yàn)分為MTT (Methyl thiazolyl tetrazolium,四甲基偶氮唑藍(lán))實(shí)驗(yàn)和Traswell侵襲實(shí)驗(yàn)兩部分：(1)MTT實(shí)驗(yàn)：將體外培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞分為對(duì)照組和電場(chǎng)治療組,電場(chǎng)治療組中使用清華大學(xué)自制的IF-AEF裝置,該裝置可產(chǎn)生頻率為10kHz-500kHz,正弦波的峰-峰值電壓(Voltage of peak to peak, Vpp)為0-30V的IF-AEF。為明確IF-AEF作用與電場(chǎng)頻率、電場(chǎng)強(qiáng)度以及作用時(shí)間的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)又分為三小部分：①頻率依賴性實(shí)驗(yàn),設(shè)對(duì)照組和多個(gè)電場(chǎng)治療組,電場(chǎng)組細(xì)胞均持續(xù)48h暴露于Vpp均為30V,頻率分別為50kHz、100kHz.200kHz.300kHz.400kHz.500kHz的IF-AEF,通過(guò)改變頻率,以明確IF-AEF作用的頻率依賴性,并明確IF-AEF對(duì)B16F10細(xì)胞作用的最佳頻率；②IF-AEF頻率設(shè)定為最佳頻率(100kHz),電場(chǎng)作用時(shí)間均為48h,電場(chǎng)治療組又再細(xì)分為3個(gè)Vpp亞組(10V、20V、30V),通過(guò)梯度改變Vpp,評(píng)估IF-AEF作用效果與電場(chǎng)強(qiáng)度的關(guān)系；③采用特定參數(shù)(頻率=100kHz,Vpp=30V)的IF-AEF對(duì)B16F10細(xì)胞進(jìn)行治療,電場(chǎng)治療組又分為兩個(gè)不同的時(shí)間處理組(24h、48h),通過(guò)梯度改變電場(chǎng)作用時(shí)間,評(píng)估IF-AEF作用效果與作用時(shí)間的關(guān)系。各組分別處理后,收集細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后MTT法測(cè)定細(xì)胞活性,計(jì)算出各組處理后的細(xì)胞增殖抑制率。(2)Traswell體外侵襲實(shí)驗(yàn)：將體外培養(yǎng)的B16F10細(xì)胞分為對(duì)照組和電場(chǎng)治療組,電場(chǎng)治療組又被分為兩個(gè)時(shí)間亞組(24h、48h),采用特定參數(shù)(頻率=100kHz,Vpp=30V)的IF-AEF對(duì)B16F10細(xì)胞進(jìn)行治療。各組分別處理后,應(yīng)用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力的改變。 結(jié)果(1)與對(duì)照組比較,頻率分別為50kHz.100kHz.200kHz.300kHz.400kHz、500kHz的IF-AEF(Vpp=30V)持續(xù)作用48h后,B16F10細(xì)胞的增殖能力均受到不同程度的抑制,各組細(xì)胞增殖抑制率分別為16.43±2.17%、27.59±3.44%、13.30±2.25%、7.08±1.03%、3.23±0.35%、2.69±0.33%,各頻率間比較其差異具有顯著性(P0.05),IF-AEF對(duì)B16F10細(xì)胞增殖抑制作用的最佳頻率為100kHz。當(dāng)Vpp分別為10V、20V、30V的IF-AEF(頻率=100kHz)電場(chǎng)作用48h后,與對(duì)照組比較,B16F10細(xì)胞的增殖能力均受到不同程度的抑制,各組細(xì)胞增殖抑制率分別為4.37±0.51%、12.43±1.46%、27.10±3.49%,電場(chǎng)組各組間比較其差異也具有顯著性(P0.05)。當(dāng)固定IF-AEF的兩個(gè)參數(shù)(頻率=100kHz,Vpp=30V)時(shí),24h處理組和48h處理組中細(xì)胞增殖能力均受到抑制,其中IF-AEF作用48h后B16F10細(xì)胞增殖抑制率為27.10±3.49%,明顯高于24h組的16.42±1.80%,兩組之間差異也具有顯著性(P0.05)。(2)細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示,頻率為100kHz的IF-AEF作用后,B16F10細(xì)胞侵襲穿過(guò)Matrigel膠到達(dá)Transwell小室膜背面的細(xì)胞數(shù)明顯減少。而B16F10細(xì)胞體外侵襲能力大小以穿過(guò)Matrigel膜的細(xì)胞數(shù)與無(wú)Matrigel時(shí)穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)的百分比表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組的侵襲率為49.79±9.12%,電場(chǎng)24h組和48h組的侵襲率分別為37.97±7.31%和27.64±5.09%,電場(chǎng)組與陰性對(duì)照組之間以及兩電場(chǎng)組者間比較其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論(1)IF-AEF對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的抑制作用具有明顯的頻率依賴性,頻率100kHz時(shí)其抑制作用最為明顯,偏離此頻率時(shí),其抑制作用明顯減弱。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),電場(chǎng)強(qiáng)度的增加,其抑制作用也增強(qiáng),即IF-AEF對(duì)B16F10細(xì)胞增殖的抑制呈現(xiàn)頻率-時(shí)間-電場(chǎng)強(qiáng)度依賴性；(2)頻率100kHz的IF-AEF能夠明顯地抑制B16F10細(xì)胞的體外侵襲能力。 第二章中頻交變電場(chǎng)對(duì)小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用及可能的機(jī)制 目的研究IF-AEF對(duì)小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用并探討其可能的作用機(jī)制。 方法將成功地在皮下接種B16F10細(xì)胞的荷瘤C57/BL6小鼠隨機(jī)進(jìn)行分組,每組各10只小鼠：實(shí)驗(yàn)組從皮下接種B16F10細(xì)胞后第3天開始施加IF-AEF(頻率=100kHz,Vpp=30V),電場(chǎng)連續(xù)作用7天,每天上下午各施加電場(chǎng)4h(8h/天)。對(duì)照組小鼠用同樣的方法固定在一樣的電場(chǎng)裝置中,但未施加電場(chǎng)。從電場(chǎng)治療后第一天開始隔兩天(治療后d1,4,7天)記錄腫瘤體積,并計(jì)算抑制率。電場(chǎng)作用7天后,各組均處死兩只實(shí)驗(yàn)小鼠,并行常規(guī)病理檢查,Bax(作為Bc1相關(guān)的x蛋白)、Bcl-2(B細(xì)胞淋巴瘤／白血病基因2)、MVD(微血管密度)、VEGF (血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)的免疫組化檢測(cè)和凋亡檢測(cè),同時(shí)運(yùn)用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))檢測(cè)對(duì)照組和IF-AEF組腫瘤組織中VEGF mRNA的表達(dá)。剩下的小鼠繼續(xù)培養(yǎng)并觀察腫瘤生長(zhǎng)情況和兩組荷瘤小鼠的長(zhǎng)期生存情況。 結(jié)果(1)實(shí)驗(yàn)組IF-AEF治療7天后小鼠腫瘤平均體積明顯小于對(duì)照組(26.33±9.82mm3vs.263.79±107.34mm3),兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。IF-AEF治療后小鼠生存期與對(duì)照組比較明顯延長(zhǎng)(29.10±3.70天vs.23.60±3.70天),兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。(2)HE染色顯示IF-AEF治療后腫瘤組織中的壞死區(qū)域比對(duì)照組明顯要大,但電場(chǎng)范圍內(nèi)的正常組織并未受到明顯的損傷,Tunel分析顯示電場(chǎng)治療后腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡,與對(duì)照組比較差異有顯著性(31.74±6.62%vs.4.51±1.34%,P0.05)。與對(duì)照組相比,電場(chǎng)治療后腫瘤組織中Bcl-2表達(dá)下降,而Bax蛋白表達(dá)增加。(3)與對(duì)照組相比,IF-AEF治療后小鼠腫瘤組織中微血管密度明顯下降(23.42±5.53vs.13.46±2.97,P0.05),同時(shí),可見腫瘤組織中VEGF蛋白表達(dá)明顯下降。電場(chǎng)組中腫瘤組織中VEGF mRNA的表達(dá)較對(duì)照組明顯減少。 結(jié)論(1)IF-AEF對(duì)皮下移植小鼠MM的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,從而導(dǎo)致電場(chǎng)治療后荷瘤小鼠的生存期延長(zhǎng),且IF-AEF對(duì)正常組織并無(wú)明顯的損傷。(2)IF-AEF可誘導(dǎo)體內(nèi)B16F10細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能為通過(guò)下調(diào)Bcl-2同時(shí)上調(diào)Bax的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。(3)IF-AEF作用后腫瘤組織中微血管密度明顯下降,其機(jī)制至少部分可能是通過(guò)抑制VEGF的功能實(shí)現(xiàn)的。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2309491