【摘要】： 前言 銀屑病(psoriasis)是在多基因遺傳背景下發(fā)生的以T細(xì)胞為主的多種免疫細(xì)胞共同參與的慢性復(fù)發(fā)性皮膚病,典型皮損為鱗屑性紅斑。目前認(rèn)為銀屑病的發(fā)病機(jī)制主要表現(xiàn)為由T細(xì)胞介導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)為靶點(diǎn)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。在T細(xì)胞因子作用下,KC可能會出現(xiàn)異常的增殖和分化；KC通過表達(dá)細(xì)胞因子參與T細(xì)胞的記憶和活化。T細(xì)胞和KC分泌的細(xì)胞因子在銀屑病中形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)可能導(dǎo)致銀屑病特有的免疫病理損傷。Th17細(xì)胞是一種新認(rèn)識的CD4+T細(xì)胞亞群,因其分泌IL-17(IL-17A)而命名,已經(jīng)證實(shí)Th17細(xì)胞在銀屑病和其它自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21和IL-23參與Thl7細(xì)胞的分化,其效應(yīng)因子IL-17可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、IL-8、GM-CSF、TNF-α、CXCL10等細(xì)胞因子,這些炎癥因子相互作用可能會誘發(fā)和加重銀屑病。 紫草為藥典收載的臨床常用傳統(tǒng)中草藥,屬于紫草科多年生草本植物,根用于藥,具有抗炎、抗腫瘤、保肝、調(diào)節(jié)免疫、避孕、殺菌和抗病毒等作用。紫草水提物、醇提物、醚提物都有此作用,常作為治療銀屑病主要的藥物。紫草主要成分有兩大類,一類為脂溶性的萘醌類色素,主要包括紫草素及其衍生物；另一類為水溶性成分紫草多糖,其多糖含量在2%左右。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察銀屑病患者血清中IL-17的含量變化及研究一定濃度IL-17對HaCaT細(xì)胞分泌VEGF、IL-6及IL-23的影響和紫草素的干預(yù)作用,試圖探討細(xì)胞因子在銀屑病發(fā)病中的作用及紫草素治療銀屑病可能的機(jī)制。 材料與方法 一、研究對象和主要試劑 (一)研究對象 1、銀屑病患者組中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科銀屑病住院患者,經(jīng)臨床確診為銀屑病,共23名,男17名,女6名,年齡23-74歲(平均49±15歲)。所有患者均無其它自身免疫性疾病史。 2、正常對照組自愿獻(xiàn)血者16名,性別年齡與患者組匹配。無銀屑病及其它自身免疫性疾病史。 所有研究對象簽訂知情同意書。根據(jù)PASI (psoriasis area and severity index,銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù))標(biāo)準(zhǔn),將銀屑病患者分為輕度、中度及重度皮損患者。 3、HaCaT細(xì)胞皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞為德國柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈。 (二)主要試劑 1、主要試劑IL-17購自美國Peprotech公司；紫草素購自日本和光(Wako)生物試劑公司；環(huán)孢素A購自德國Merck公司；CCK-8購自日本同仁化學(xué)研究所；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS及1%青鏈霉素購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自美國GIBICO公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國AMRESCO公司；人IL-17定量ELISA試劑盒購自美國Rapidbio公司；人VEGF定量ELISA試劑盒及人IL-6 ELISA試劑盒購自武漢博士德公司；人IL-23定量ELISA試劑盒購自美國RD公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板及12孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國BD Pharmingen公司。 2、主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、倒置相差顯微鏡、低溫超速離心機(jī)、臺式高速離心機(jī)、-80℃深低溫冰箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、電腦壓力蒸汽滅菌器、電熱恒溫水箱、酶標(biāo)儀。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為IL-17刺激組及藥物組,HaCaT細(xì)胞以每孔1×105個(gè)／ml接種于12孔板,在不同處理?xiàng)l件下培養(yǎng)3天。每組平行設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)培養(yǎng)6次細(xì)胞,分別檢測。 (1)IL-17刺激組分為4組：空白對照組(DMEM培養(yǎng)24h)、IL-17刺激24h組(IL-17 80ng／ml+DMEM培養(yǎng)24h)、IL-17刺激36h組(IL-17 80ng／ml+DMEM培養(yǎng)36h)、IL-17刺激48h組(IL-17 80ng/ml+DMEM培養(yǎng)48h)。 (2)藥物組分為4組：空白對照組(DMEM培養(yǎng)24h)、紫草素+IL-17組(紫草素50umol／L+IL-17 80ng／ml+DMEM培養(yǎng)48h)、環(huán)孢素A+IL-17組(環(huán)孢素A 10umol／L+IL-17 80ng／ml+DMEM培養(yǎng)48h)、IL-17組(IL-1780ng/ml+DMEM培養(yǎng)48h)。 2、ELISA法檢測銀屑病患者血清中IL-17的含量及IL-17刺激組、藥物組VEGF、IL-6、IL-23的含量。 3、CCK-8檢測藥物組HaCaT細(xì)胞活力。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、與正常人相比,銀屑病患者血清中IL-17含量顯著升高(18040.23±8045.54v.s 2954.86±1433.74,P0.05)。根據(jù)銀屑病PASI評分,輕度、中度及重度皮損的患者血清中IL-17平均相對表達(dá)量分別為3466.37±1294.77、7928.59±1143.94、20319.74±6260.72,與輕、中度皮損的銀屑病患者相比,重度皮損的患者血清中IL-17含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 2、IL-17刺激組及藥物組ELISA檢測結(jié)果 (1)IL-17刺激組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清中各因子的表達(dá)水平80ng／ml IL-17刺激HaCaT細(xì)胞0h、24h、36h、48h后VEGF平均相對表達(dá)量分別為340.76±57.80、333.54±56.58、510.11±107.62、791.70±55.85；IL-6平均相對表達(dá)量分別為107.50±23.80、144.48±44.26、210.48±30.02、220.37±35.74；IL-23平均相對表達(dá)量分別為96.49±4.35、62.37±8.50、121.35±13.10、161.91±12.77；不同時(shí)間IL-17刺激組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF、IL-6、IL-23的表達(dá)高于空白對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 (2)藥物組HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清中各因子的表達(dá)水平80ng/ml IL-17、50umol／L紫草素和10umol／L環(huán)孢素A共同作用HaCaT細(xì)胞48h后空白對照組、紫草素+IL-17組、環(huán)孢素A+IL-17組及IL-17組中VEGF平均相對表達(dá)量分別為328.45±35.97、511.22±50.29、490.47±33.15、798.42±99.52；IL-6平均相對表達(dá)量分別為107.95±20.04、133.88±33.85、135.57±26.41、220.59±34.66；IL-23平均相對表達(dá)量分別為100.07±10.25、119.16±16.47、129.28±13.36、178.63±27.01；紫草素及環(huán)孢素A處理組VEGF、IL-6、IL-23的表達(dá)均低于IL-17組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 3、用CCK-8檢測藥物組HaCaT細(xì)胞活力紫草素處理組細(xì)胞的存活率(%)為101%,環(huán)孢素A處理組細(xì)胞的存活率(%)為101%,藥物組中空白對照組、紫草素+IL-17組、環(huán)孢素A+IL-17組及IL-17組的細(xì)胞活力OD值分別為1.115±0.011、1.125±0.142、1.125±0.085、1.126±0.129,各組細(xì)胞活力無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論 1、銀屑病患者血清中IL-17含量顯著升高。 2、IL-17刺激HaCaT細(xì)胞后VEGF、IL-6及IL-23的表達(dá)量升高,并呈時(shí)間依賴性,IL-17具有促進(jìn)炎癥因子分泌的作用。 3、紫草素可抑制IL-17促進(jìn)炎癥因子分泌的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R758.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2282683