本文關鍵詞：胎盤間充質干細胞對小鼠特應性皮炎樣模型的影響及機制探討，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《蘇州大學》 2014年

胎盤間充質干細胞對小鼠特應性皮炎樣模型的影響及機制探討

余珊珊  

【摘要】：目的：(1)分離培養(yǎng)人胎盤間充質干細胞(placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)備用；(2)建立特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)樣動物模型；(3)探討PMSCs對小鼠AD樣皮損的影響；(4)探討PMSCs對AD樣動物模型引流淋巴結和脾臟中Foxp3+Treg數(shù)量的影響；(5)PMSCs在小鼠AD樣模型中對皮損IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ的影響及機制。 方法：(1)PMSCs分離用組織塊法聯(lián)合酶消化法，鑒定采用流式細胞儀檢測細胞表面分子，體外誘導其分化成脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞；(2)用1%5-異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)誘發(fā)BALB/c小鼠建立急性(激發(fā)1次)和慢性(每3d激發(fā)1次，共7次)AD樣模型；(3)靜脈注射不同劑量的PMSCs(0.5×106，1×106或2×106個/次/只)治療小鼠急(1次)、慢性(2次)AD樣模型，肉眼觀察小鼠耳朵和背部皮膚的變化，動態(tài)測量小鼠耳厚度，處死前稱重，處死后稱其耳和脾臟重量，計算左右耳的重量差以及脾臟指數(shù)；(4)用流式細胞術檢測小鼠脾臟及耳部引流淋巴結的Foxp3+Treg細胞；(5)用流式細胞儀微球捕獲芯片技術法(CBA)檢測小鼠背部皮膚組織勻漿中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ含量；(6)小鼠耳朵和背部皮膚進行常規(guī)組織病理切片和HE染色，光鏡下觀察其皮膚病理改變，并計算表皮層數(shù)和真皮中的炎癥細胞數(shù)。 結果： （一）成功分離、鑒定、擴增PMSCs PMSCs表面表達CD29、CD90、CD105，CD34、CD45、HLA-DR為陰性，PMSCs體外誘導可分化為成脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞。 （二）成功建立小鼠AD樣模型 (1)急性AD樣模型激發(fā)前左耳厚度(24.90±0.89)×10-3mm，激發(fā)12h后耳廓和背部皮膚可見輕度水腫性紅斑，24h后厚度達到(28.00±1.06)×10-3mm，48h時達高峰(28.70±0.67)×10-3mm，此時左耳重量為(13.88±0.61)mg，左右耳的重量差為(0.84±0.72)mg。耳和背部皮膚的組織病理變化類似急性皮炎，表現(xiàn)為表皮輕微水腫和增厚，真皮淺層水腫，小血管擴張，較多的炎癥細胞浸潤(主要是單一核細胞和少許多形核細胞)，與基質組比較，耳和背部的浸潤細胞數(shù)增多(P0.05)、背部的表皮層數(shù)增多(P0.05)。模型組小鼠皮損中Th1、Th2細胞因子均升高，IFN-γ/IL-4比值比基質組下降，此小鼠中出現(xiàn)以Th2占優(yōu)勢的Thl/Th2的平衡失調(diào)。 (2)慢性AD樣模型第1次激發(fā)前左耳厚度(27.00±1.27)×10-3mm，第1次激發(fā)12h后即出現(xiàn)輕度水腫性紅斑，隨著激發(fā)次數(shù)的增多，水腫性紅斑逐漸加重，并可見滲出結痂、鱗屑和毛發(fā)脫落(主要見于背部)，，第28d(處死前)耳厚度為(39.30±4.15)×10-3mm，左耳重量為(19.60±3.86)mg，左右耳的重量差為(5.24±3.26)mg。光鏡下皮膚呈亞急性和慢性皮炎樣改變：耳部皮膚可見表皮角質層較明顯增厚，偶見血清痂，棘層增厚(4～5層)，真皮內(nèi)有大量的細胞浸潤(主要是單一核細胞和少許多形核細胞)；背部皮膚表現(xiàn)為表皮顯著角化過度，角化不全，棘層明顯增厚(6～8層)，有細胞外移，偶見血清痂，真皮內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤(主要是單一核細胞)，與基質組相比，浸潤細胞數(shù)和棘層層數(shù)均明顯增多(P0.05~0.01)。模型組小鼠皮損中IFN-γ/IL-4比值仍低于基質組，Th2占優(yōu)勢的Thl/Th2的平衡失調(diào)依然存在。 （三）PMSCs對小鼠AD樣模型的影響 (1)急性小鼠AD樣模型激發(fā)后24h時，PMSCs注射的高劑量組小鼠耳厚低于模型組(P0.05)，中劑量組亦小于模型組，但差異無顯著性(P＞0.05)，48h時，中、高劑量組的耳厚度小于模型組(P0.05)。其效果與劑量呈正相關；PMSCs中、高劑量組的耳重量小于模型組，但無統(tǒng)計學意義(P0.05)。在組織病理片上，中、高劑量組耳和背部皮膚中的真皮浸潤細胞數(shù)和背部表皮的層數(shù)均低于模型組(P均0.05)，表明PMSCs對急性AD樣皮損有治療作用； (2)慢性小鼠AD樣模型PMSCs高劑量組在激發(fā)1d后與模型組相比耳厚度小于模型組(P0.05)，在4d后中、高劑量組耳的厚度均小于模型組(P0.05)，且高劑量的療效好于低劑量組；PMSCs各劑量組耳重量均輕于模型組，但無顯著性差異(P0.05)。組織病理學方面，高劑量組的耳和背部皮膚真皮中浸潤細胞數(shù)以及背部的表皮厚度小于模型組(P0.05)，中劑量組的浸潤細胞數(shù)亦低于模型組(P0.05)；此外，高劑量組真皮內(nèi)的浸潤細胞數(shù)和背部表皮的厚度小于中劑量組(P均0.05)，說明PMSCs對慢性小鼠AD樣皮損亦有治療作用，且其療效與細胞濃度有關。 (四)PMSCs對小鼠AD樣模型中Foxp3+Treg細胞數(shù)量的影響 中、高劑量PMSCs可促進AD樣小鼠急性期引流淋巴結中Foxp3+Treg的生成，對脾臟中Foxp3+Treg細胞數(shù)未見明顯影響。 (五)各組小鼠皮損中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ的變化 (1)與急性基質對照組相比，急性模型組皮損中Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平顯著升高，Th1型細胞因子IL-2升高、IFN-γ無明顯變化，炎性因子TNF顯著升高，Th17細胞特異性標志IL-17A顯著升高(P0.05)，模型組IFN-γ/IL-4(1.32±0.76)低于基質組(2.11±0.86)，提示該模型是由Th2型免疫反應所致。 (2)與慢性基質對照組相比，慢性模型組皮損中Th2型細胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平升高，Th1型細胞因子IFN-γ輕度升高、IL-2無明顯變化，炎性因子TNF顯著升高，Th17細胞特異性標志IL-17A無明顯改變，慢性組IFN-γ/IL-4(0.73±0.64)小于基質組(1.34±0.41)，提示該慢性模型組亦是以Th2型免疫反應為主。 (3)地塞米松對小鼠AD樣模型治療的作用機制 地塞米松可顯著抑制急性小鼠AD樣模型皮損中IL-2、IL-4水平，輕微減少TNF、IFN-γ的產(chǎn)生，對IL-6、IL-10無明顯影響，使IFN-γ/IL-4(2.76±3.53)升高，使皮損中的炎性因子TNF減少以及IL-17A下降，表明地塞米松可以通過調(diào)控Th1/Th2細胞的失衡來減輕皮損炎癥。 (4)PMSCs對小鼠AD樣模型治療的作用機制 ①與急性模型組比較，低、中劑量PMSCs引起小鼠急性AD樣模型皮膚中Th2細胞因子IL-6、IL-10明顯下降，中劑量組中IL-4下降，低劑量組中IL-4無明顯改變，而高劑量組致使皮損中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17A升高；使低、中劑量組的IFN-γ/IL-4(0.86±0.28、0.97±0.22)減少，高劑量組的(2.12±1.55)升高，并趨于正常，提示PMSCs對Th1、Th2、Th17的影響隨著濃度的高低可能具有雙向調(diào)節(jié)作用，且與細胞濃度相關。 ②與慢性模型組比較，PMSCs可使皮損中的IL-10和TNF減少，但對其他因子無明顯影響。 結論： (1)成功分離PMSCs； (2)用1%FITC誘導BALB/c小鼠成功建立以Th2型免疫反應為主的急、慢性AD樣模型； (3)靜脈給予PMSCs可減輕小鼠急、慢性AD樣皮膚炎癥，且療效與劑量有關，其機制可能是通過調(diào)控Th1/Th2、Treg/Th17細胞失衡發(fā)揮治療作用。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R758.2
【目錄】：

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