發(fā)布時(shí)間：2018-10-05 07:16

【摘要】：背景 銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病,其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚,目前認(rèn)為是一種在多基因遺傳背景下、受多種內(nèi)外環(huán)境因素刺激和誘導(dǎo)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病,以角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte, KC)過(guò)度增生、新生血管形成、炎細(xì)胞浸潤(rùn)為其組織病理改變的三要素。在銀屑病的組織病理變化中真皮乳頭血管的異常最先發(fā)生,而后出現(xiàn)炎癥細(xì)胞的移行和表皮增生及分化異常,由此啟動(dòng)銀屑病發(fā)生發(fā)展過(guò)程。同時(shí),大量的免疫活性細(xì)胞如：T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子滲出到血管外的組織中,誘導(dǎo)KC活化、增殖并分泌大量細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子等,反過(guò)來(lái)促進(jìn)血管異常的加重,由此形成細(xì)胞因子相互調(diào)控的惡性循環(huán),促進(jìn)疾病的進(jìn)展。 趨化因子(chemokine, CK)是一類特異性地吸引白細(xì)胞的小分子蛋白質(zhì),分為C、CC、CXC和CX3C四個(gè)亞族。趨化因子通過(guò)靶細(xì)胞膜上的趨化因子受體(ckemokine receptor)起作用。目前研究認(rèn)為,趨化因子及其受體結(jié)合,是調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞遷移的主要刺激因子,除此之外,它在神經(jīng)傳導(dǎo)、新生血管生成及炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮重要作用。多種趨化因子及其受體參與了銀屑病的發(fā)病。研究表明,趨化因子在銀屑病的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中高表達(dá),KC是這些趨化因子的主要來(lái)源。在經(jīng)UVB、阿維A及依那昔普等治療銀屑病時(shí),隨其臨床表現(xiàn)的改善,KC表達(dá)趨化因子明顯下降。 CCL27亦稱人皮肽T細(xì)胞虜獲趨化因子(Cutaneous T cell-attracting chemokine,CTACK)主要由皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生,僅對(duì)皮膚淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CLA)陽(yáng)性記憶性T細(xì)胞具有較強(qiáng)的趨化作用。CCR10是CCL27的唯一受體,CCL27/CCR10的相互作用在T細(xì)胞介導(dǎo)的皮膚炎性反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CCL27及CCR10在銀屑病患者皮損表達(dá)明顯增多,且表達(dá)水平與PASI評(píng)分呈明顯正相關(guān),提示CCL27參與了銀屑病的發(fā)病過(guò)程,其表達(dá)水平與銀屑病的病情嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。CCL27通過(guò)吸引更多的CCR10+/CLA+記憶性T細(xì)胞聚集于皮膚,在角質(zhì)形成細(xì)胞和T細(xì)胞之間起了一定的橋梁作用,使銀屑病皮膚的炎性反應(yīng)加重和持續(xù)。 臨床觀察發(fā)現(xiàn),劇烈的精神刺激或應(yīng)激反應(yīng)可誘發(fā)和加重銀屑病。既往研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽廣泛存在于皮膚神經(jīng)纖維和多種皮膚細(xì)胞如KC、朗格漢斯細(xì)胞、黑素細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等,同時(shí)上述細(xì)胞表面均分布有神經(jīng)肽的受體。由于神經(jīng)系統(tǒng)與皮膚免疫系統(tǒng)多種靶細(xì)胞之間有密切聯(lián)系,伸入皮膚的感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽與表皮和真皮多種細(xì)胞接觸,可直接修飾角質(zhì)形成細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞,影響這些細(xì)胞的增殖和活化以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗原呈遞,在銀屑病發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)肽CGRP是人皮膚組織中重要的神經(jīng)遞質(zhì),含37個(gè)氨基酸殘基,由降鈣素基因編碼,有較強(qiáng)的舒張真皮微血管作用,能刺激人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化,使其分泌趨化因子IL-8；誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的粘附作用。此外,CGRP能上調(diào)角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)表達(dá)IL-1,誘導(dǎo)單核細(xì)胞合成IL-8及MCP-1,增強(qiáng)對(duì)中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的趨化作用；還可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞表達(dá)nNOS和釋放NO,參與皮膚內(nèi)微血管擴(kuò)張和神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)。早已證實(shí),在某些與精神因素相關(guān)的疾病如銀屑病等皮損及血漿中神經(jīng)肽CGRP的表達(dá)量顯著增加,局部皮損CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量也增加,提示CGRP可能在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色。 CGRP作用于CGRP受體后有多種信號(hào)途徑。包括環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphatec, cAMP),細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子(Intracellular Ca2+)和絲裂原激活激酶(Mitogen-activated protein kinase MAPK)及NF-κB等信號(hào)通路。業(yè)已證實(shí),CGRP可以作為絲裂原刺激KC增殖,并促進(jìn)皮損局部血管內(nèi)皮增生,從而參與銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,而CGRP是否參與銀屑病炎細(xì)胞的趨化過(guò)程,CGRP是否促進(jìn)KC對(duì)炎細(xì)胞的趨化活性尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此,本研究擬在體外培養(yǎng)的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株-HaCaT細(xì)胞中,以主要由KC細(xì)胞分泌的趨化因子CCL27為主要指標(biāo),觀察CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL27的影響及其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,以闡明CGRP在銀屑病發(fā)病、發(fā)展中作用機(jī)制。 目的 1、觀察CGRP對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞株-HaCaT細(xì)胞趨化淋巴細(xì)胞的影響。 2、觀察CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌和表達(dá)趨化因子CCL-27的影響。 3、探討ERK1/2、p38MAP、IκB-α/NF-κB信號(hào)途徑在CGRP誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞分泌趨化因子CCL27中的作用。 方法 1.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞用含10%FBS的DMEM放置370C、5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。 2.分別分離銀屑病及健康對(duì)照外周血T淋巴細(xì)胞。 3.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1)HaCaT細(xì)胞給予CGRP孵育,部分給予CGRP8-37、PD98059、SB203580、 PDTC預(yù)處理,運(yùn)用Transwell系統(tǒng)觀察檢測(cè)CGRP對(duì)T淋巴細(xì)胞趨化功能的影響。 2)HaCaT細(xì)胞給予不同濃度CGRP孵育,部分給予CGRP受體拮抗劑CGRP8-37、ERKI/2阻斷劑PD98059、p38MAPK阻斷劑SB203580、IκB-α阻斷劑PDTC預(yù)處理測(cè)定HaCaT細(xì)胞分泌趨化因子CCL-27mRNA及蛋白表達(dá)； 3) HaCaT細(xì)胞給予CGRP孵育,部分給予CGRP8-37、PD98059、SB203580或PDTC測(cè)定ERK1/2、p38磷酸化及IκB-α改變； 4.實(shí)驗(yàn)方法 4.1Transwell系統(tǒng)檢測(cè)CGRP對(duì)T淋巴細(xì)胞趨化功能的影響。 分離進(jìn)展期銀屑病患者及健康對(duì)照外周血T淋巴細(xì)胞,加入PHA (200ng/ml)預(yù)先孵育6h使淋巴細(xì)胞活化,加入含5%牛血清白蛋白的RPMI-1640培養(yǎng)液制備細(xì)胞懸液,用24孔趨化小室檢測(cè)淋巴細(xì)胞趨化活性。 4.2實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)檢測(cè)CCL27mRNA表達(dá)。 將所收集的細(xì)胞提取總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA,以管家基因β-actin作為參照,通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CCL27mRNA的表達(dá)。 4.3雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)CCL27蛋白表達(dá) 將所收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行孵育、酶反應(yīng)、顯色等步驟,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nln處測(cè)量各孔吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度。 4.4Westernblot檢測(cè)磷酸化ERK1/2、p38及IκB-α蛋白表達(dá) 將所收集的細(xì)胞提取總蛋白,經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、DAB顯色、凝膠成像系統(tǒng)成像、ImageTool(IT)3.0進(jìn)行進(jìn)行半定量分析,檢測(cè)p-ERK1/2、p-p38、IκB-α蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1. CGRP促進(jìn)HaCaT細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化活性 神經(jīng)肽CGRP在一定程度上,能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞趨化活性,銀屑病組及健康對(duì)照組其趨化指數(shù)CI分別為6.65±0.21和4.25±0.16,兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；用CGRP3-87、PD98059、SB203580、PDTC預(yù)處理后,可以使CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞趨化淋巴細(xì)胞的活性明顯減弱,銀屑病組趨化指數(shù)CI分別為2.52±0.26、2.82±0.05、2.02±0.17、2.89±0.14；健康對(duì)照組趨化指數(shù)C1分別為1.57±0.11、1.74±0.03、1.65±0.08、1.82±±0.04。 2.不同濃度的CGRP對(duì)HaCaT細(xì)胞CCL27mRNA表達(dá)和蛋白分泌的影響 CGRP呈濃度依賴性促進(jìn)CCL27mRNA和蛋白表達(dá),與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01),其中CGRP濃度為10nM時(shí)CCL27mRNA和蛋白表達(dá)最高。 3. CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC對(duì)CGRP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞CCL27mRNA表達(dá)和蛋白分泌影響 CGRP8-37、PD98059、SB203580、PDTC預(yù)處理后,CGRP誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞CCL27mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(p0.01)；但仍高于正常對(duì)照組(p0.01)。 4. ERK1/2、P38MAPK、IκB-α/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在CGRP促HaCaT細(xì)胞表達(dá)CCL27中的作用 CGRP在一定范圍內(nèi)時(shí)間依賴性促進(jìn)ERK1/2、P38的磷酸化,CGRP8-37預(yù)處理組p-ERK1/2、p-38表達(dá)明顯降低,PD98059預(yù)處理組p-ERK1/2表達(dá)明顯降低,SB203580預(yù)處理后p-38表達(dá)明顯降低。 CGRP在一定范圍內(nèi)時(shí)間依賴性促進(jìn)IκB-α的磷酸化降解,CGRP在作用10min后IκB-α開(kāi)始降解,60min內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)；CGRP8-37及PDTC預(yù)處理明顯抑后明顯抑制CGRP誘導(dǎo)的IκB-α降解。 結(jié)論 1、CGRP能促進(jìn)HaCaT細(xì)胞對(duì)活化淋巴細(xì)胞的趨化活性； 2、CGRP可以上調(diào)HaCaT細(xì)胞CCL27mRNA和蛋白表達(dá)； 3、CGRP可以時(shí)間依賴性活化HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38MAPK、 IKB-a/NF-KB信號(hào)途徑； 4、ERK1/2、p38MAPK、IκB-α/NF-κB信號(hào)途徑可能參與了CGRP上調(diào)HaCaT細(xì)胞CCL27表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R758.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2252491