【摘要】：背景 1982年Mulliken和Glowacki根據(jù)脈管性疾病的臨床表現(xiàn)、組織病理學(xué)特征和生物學(xué)行為將其分為兩大類：血管畸形和血管瘤。血管畸形與血管瘤最大的區(qū)別是：血管畸形出生時(shí)出現(xiàn),隨身體發(fā)育相應(yīng)的生長,沒有自然消褪跡象；而血管瘤出生時(shí)表現(xiàn)為小紅點(diǎn)或小紅斑,大部分在2周開始增長,3-6個(gè)月內(nèi)生長明顯,9-12月達(dá)到高峰,12-18個(gè)月出現(xiàn)消褪,90%在9年內(nèi)消失。同時(shí)后者常見于嬰幼兒,所以主張用“嬰幼兒血管瘤”來命名從而更有利于對這類疾病的理解。 病理學(xué)上嬰幼兒血管瘤主要表現(xiàn)為增殖期內(nèi)皮細(xì)胞大量的自我克隆增殖和微血管形成,消褪期內(nèi)皮細(xì)胞消散、微血管塌陷、脂肪和纖維組織堆積。故許多研究者致力于研究內(nèi)皮細(xì)胞來源、微血管形成機(jī)制及消褪期內(nèi)皮細(xì)胞凋亡原因,而近來研究表明嬰幼兒血管瘤中含有的豐富非內(nèi)皮細(xì)胞也積極參與到此病理演變過程中。有資料表明嬰幼兒血管瘤中樹突狀細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子VEGF參與血管瘤的形成；增生期肥大細(xì)胞釋放VEGF、Ⅷ型膠原刺激血管形成,促進(jìn)血管瘤的增生；Ritter等發(fā)現(xiàn)缺氧會刺激增生期髓樣細(xì)胞分泌血管生成因子而促進(jìn)微血管形成。作為一種免疫相關(guān)細(xì)胞,巨噬細(xì)胞同樣大量存在于血管瘤中,其分布變化和作用卻鮮有報(bào)道。 免疫學(xué)研究表明巨噬細(xì)胞是一種具有可塑性和多能性的細(xì)胞群體,在不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下表現(xiàn)出明顯的功能差異。巨噬細(xì)胞主要分為Ml型即經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞和M2型即替代激活型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌IL-23、IL-12和支持Thl激活,從而具有呈遞抗原、吞噬異物、殺滅微生物和腫瘤細(xì)胞的能力,達(dá)到抗增殖、抗腫瘤的作用；相反M2型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生IL-8、VEGF、bFGF等血管因子,促進(jìn)微血管的生成,同時(shí)分泌各種蛋白酶女口MMPs、MMP-9和upA來降解細(xì)胞外基質(zhì),為新生血管向正常組織中遷移創(chuàng)造有利條件,起到促進(jìn)血管、淋巴生長,幫助腫瘤遷移的作用。既然嬰幼兒血管瘤存在一個(gè)明顯的增殖與消褪過程,同時(shí)有研究表明其中又含有豐富巨噬細(xì)胞,那么在增殖期出現(xiàn)的是不是M2型巨噬細(xì)胞?隨著進(jìn)入消褪期,在局部微環(huán)境改變的情況下,是不是也存在著從M2型向M1型轉(zhuǎn)變的可能性,進(jìn)而反過來促進(jìn)嬰幼兒血管瘤從增殖向消褪狀態(tài)轉(zhuǎn)變?如能觀察到這一變化,將為深入研究巨噬細(xì)胞如何調(diào)控嬰幼兒血管瘤的增殖與消褪提供理論基礎(chǔ),進(jìn)而為臨床干預(yù)開啟一有意義的治療途徑。 就目前而言,尚未見研究嬰幼兒血管瘤不同時(shí)期巨噬細(xì)胞分布及表型變化的報(bào)導(dǎo)。 目的 通過檢測不同時(shí)期嬰幼兒血管瘤中的巨噬細(xì)胞類型,探討其在增殖與消褪病理變化過程中的分布及表型變化規(guī)律,為深入研究巨噬細(xì)胞在嬰幼兒血管瘤中調(diào)控微血管生長的機(jī)制提供依據(jù)。 方法 1.收集標(biāo)本,進(jìn)行Glut一1檢測,排除血管畸形標(biāo)本 收集贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科診斷為血管瘤的標(biāo)本46例。參照袁斯明等的方法將標(biāo)本分為4個(gè)階段：增生早期(1-3個(gè)月,7例)、增生中期(4-6個(gè)月,17例)、增生晚期(7-12個(gè)月,16例)、消退早期(1-3歲,6例)。進(jìn)行Glut—1免疫組化標(biāo)記,區(qū)分嬰幼兒血管瘤和血管畸形,同時(shí)行常規(guī)HE染色,比較兩者病理特點(diǎn)。 2.嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性檢測 利用Ki-67行免疫組化檢測,內(nèi)皮細(xì)胞陽性率大于10%為陽性表達(dá),探討內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性高低在分期和預(yù)測嬰幼兒血管瘤是否消褪中的意義。 3.檢測嬰幼兒血管瘤中巨噬細(xì)胞表型 用CD68、CD16/32、CD163分別標(biāo)記非特異性巨噬細(xì)胞、M1型和M2型巨噬細(xì)胞,觀察在血管瘤組織中的分布及變化。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齊用Welch法進(jìn)行矯正；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí),方差齊用SNK法兩兩比較,方差不齊用Dunnett T3方法兩兩比較。 結(jié)果 1.43例標(biāo)本內(nèi)皮細(xì)胞Glut一1表達(dá)陽性,確定為嬰幼兒血管瘤,3例陰性,為血管畸形。病理表現(xiàn)：嬰幼兒血管瘤瘤體被厚薄不一的纖維組織分隔而呈“分葉狀”,血管畸形無“分葉狀”結(jié)構(gòu)。增生早期“分葉狀”結(jié)構(gòu)從中央到邊緣大致可分為三個(gè)“區(qū)”,中心幼稚區(qū)、中間過渡區(qū)和邊緣分化成熟區(qū)；到增生晚期和消褪早期,三個(gè)區(qū)的結(jié)構(gòu)逐漸難以分辨。 2.43例嬰幼兒血管瘤標(biāo)本,Ki-67表達(dá)陽性率均低于10%,為陰性表達(dá)。 3.CD68陽性巨噬細(xì)胞(非特異性巨噬細(xì)胞)在嬰幼兒血管瘤各期中均有出現(xiàn)；4期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.815,P=0.000),增生早期、增生中期和增生晚期三期之間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),三期與消褪早期之間相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且高于后者。CD163陽性巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)增生早期陽性表達(dá)率為20.93%,主要出現(xiàn)于小于3個(gè)月的血管瘤標(biāo)本中,大于3個(gè)月陽性表達(dá)迅速減弱；增生早期和增生中期的95%可信區(qū)間未包括0,與增生晚期和消褪早期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,比較增生早期和增生中期兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.778,P=0.000),且前者高于后者,可見M2型巨噬細(xì)胞主要在增生早期發(fā)揮作用。CD16/32陽性巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)在增生早期未見表達(dá),少量增生中期標(biāo)本中開始出現(xiàn)陽性表達(dá),與M2型巨噬細(xì)胞出現(xiàn)無明顯交集,增生晚期逐漸增強(qiáng)陽性率為8.07%；增生晚期的95%可信區(qū)間未包括0,與增生早期和消褪早期之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；增生中期的95%可信區(qū)間包括0,與增生早期和消褪早期之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；比較增生晚期和增生中期兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.853,P=0.000),且前者高于后者,可見M1型巨噬細(xì)胞主要在增生晚期發(fā)揮作用。 討論 1.血管瘤和血管畸形病理表現(xiàn)區(qū)別及意義 目前我國許多醫(yī)院仍未對血管瘤和血管畸形進(jìn)行明確區(qū)分,而是統(tǒng)稱為血管瘤,故在我們收集的標(biāo)本中極有可能混雜著血管畸形標(biāo)本,將其剔除才能保證后面實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。雖然根據(jù)臨床表現(xiàn)可將兩者分開,但病理學(xué)上的區(qū)別應(yīng)更為客觀。2000年North等發(fā)現(xiàn)在嬰幼兒血管瘤的各個(gè)時(shí)期Glut-1都有顯著性表達(dá),而在其它血管腫瘤或畸形中表達(dá)不明顯,從而將Glut-1作為嬰幼兒血管瘤區(qū)別于血管畸形特殊而有用的免疫組化標(biāo)記。我們在實(shí)驗(yàn)中再次證實(shí)了這一結(jié)果,各期嬰幼兒血管瘤標(biāo)本內(nèi)皮細(xì)胞Glut-1染色均成陽性,而血管畸形為陰性,從而客觀地將兩者區(qū)分。 通過觀察嬰幼兒血管瘤和血管畸形在病理表現(xiàn)上的不同,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前者瘤體被厚薄不一的纖維組織分隔而呈“分葉狀”,后者病灶無邊界,無“分葉狀”結(jié)構(gòu),主要由大小不等的血管組成。故此“分葉狀”的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)應(yīng)該可以作為病理上鑒別兩者的標(biāo)準(zhǔn)之一 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),每一“葉”細(xì)胞及組織分布有相似的特點(diǎn),即從中央到邊緣可分為三個(gè)“區(qū)”：中心幼稚區(qū)、過渡區(qū)和邊緣成熟區(qū),尤其在增生早期表現(xiàn)特別明顯。這一病理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能有助于我們進(jìn)一步了解嬰幼兒血管瘤中增生微血管的來源機(jī)制。 血管的生成主要有兩種機(jī)制：血管發(fā)生和血管形成。血管發(fā)生(vasculogensis)是指由成血管細(xì)胞發(fā)育成原始的血管；血管形成(angiogenesis)是指毛細(xì)血管由已存在的血管中發(fā)芽長出。起初,象其它腫瘤一樣,血管形成被認(rèn)為是嬰幼兒血管瘤微血管的主要來源；2004年Nguyen發(fā)現(xiàn),嬰幼兒血管瘤中微血管結(jié)構(gòu)和對單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞標(biāo)記染色呈陽性的血管周圍細(xì)胞共同出現(xiàn),從而提出微血管是血管發(fā)生而非血管形成的結(jié)果；我們通過對增殖期嬰幼兒血管瘤標(biāo)本進(jìn)行整體觀察和分析“分葉狀”結(jié)構(gòu)演變過程特點(diǎn),可以想象,血管瘤中被纖維組織分隔的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)作為一個(gè)發(fā)生中心,在不斷增殖膨脹的同時(shí),重組排列生成新的微血管,并向周圍組織擴(kuò)展,在移行過程中不斷地修整、改建,進(jìn)化成成熟血管,從而更簡潔明了地表明嬰幼兒血管瘤中微血管主要來源于血管發(fā)生的結(jié)果。 2.嬰幼兒血管瘤增殖活性與預(yù)后 1987年Bauer等首次證明了增殖活性在腫瘤預(yù)后中的重要作用,隨后Schutte等進(jìn)一步提出腫瘤細(xì)胞增殖活性可以作為判斷預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。增殖期嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞具有自我克隆性,檢測其增殖活性,對嬰幼兒血管瘤的分期、預(yù)后具有重要意義。 實(shí)驗(yàn)表明嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Ki-67呈持續(xù)性低水平表達(dá),不足10%,為陰性表達(dá),說明實(shí)驗(yàn)標(biāo)本代表的嬰幼兒血管瘤病例增殖活性不高。這一結(jié)果使我們推測：1、因患者大部分是嬰幼兒,手術(shù)人員在前期選擇病人時(shí)就有意無意將臨床上增生范圍廣泛、快速,難以切除的病例排除在外,而是選擇病灶局限、增長緩慢、易于切除的患兒進(jìn)行手術(shù)。2、標(biāo)本代表的這部分病例內(nèi)皮細(xì)胞自我克隆增殖難以跟上向微血管演變的速度,臨床上可能更早地進(jìn)入消褪期,殘留的畸形也應(yīng)更不明顯,預(yù)后較好,反而不需要早期積極干預(yù),應(yīng)以保守治療為王。 3.巨噬細(xì)胞在嬰幼兒血管瘤中的作用 嬰幼兒血管瘤有其獨(dú)特自然病史,病理上主要是內(nèi)皮細(xì)胞和微血管的變化,因而以往多致力于研究內(nèi)皮細(xì)胞方面,探討其起源和如何生成微血管,而近來研究表明,嬰幼兒血管瘤中含有的豐富非內(nèi)皮細(xì)胞也積極參與到病理演變過程中。巨噬細(xì)胞作為一種免疫相關(guān)細(xì)胞,同樣大量出現(xiàn)于嬰幼兒血管瘤中,也應(yīng)在其中發(fā)揮重要作用。 免疫學(xué)研究表明巨噬細(xì)胞是一種具有可塑性和多能性的細(xì)胞群體,在不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)下表現(xiàn)出明顯的功能差異。其中M1型巨噬細(xì)胞具有呈遞抗原、吞噬異物、殺滅微生物和腫瘤細(xì)胞的能力,從而達(dá)到抗增殖、抗腫瘤的作用；而M2型巨噬細(xì)胞起到促進(jìn)血管、淋巴生長,幫助腫瘤遷移的作用。 我們研究顯示增生早期巨噬細(xì)胞大量出現(xiàn)于內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)外圍并聚集于新生血管周圍；在增生中期巨噬細(xì)胞數(shù)量減少,向瘤體內(nèi)彌散；進(jìn)入增生晚期、消退早期巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯稀少,散布于微血管、細(xì)胞之間。表明巨噬細(xì)胞存在于各個(gè)階段,參與了嬰幼兒血管瘤增殖與消褪的病理變化過程,而觀察其表型變化,有助于進(jìn)一步判斷其是否對血管瘤演變產(chǎn)生影響。 通過特異性標(biāo)記CD163發(fā)現(xiàn),聚集于早期嬰幼兒血管瘤新生血管周圍的巨噬細(xì)胞為M2型。根據(jù)以往報(bào)道M2型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生各種血管因子,促進(jìn)微血管的生成,同時(shí)分泌各種蛋白酶來降解細(xì)胞外基質(zhì),為新生血管向正常組織中遷移創(chuàng)造有利條件,此時(shí)大量出現(xiàn)使我們有理由相信其在血管瘤增殖早期微血管生成中扮演著重要角色。同時(shí)增生晚期和消褪早期標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)CD16/32陽性M1型巨噬細(xì)胞,有資料顯示其可分泌各種細(xì)胞因子,直接或間接作用于成纖維細(xì)胞和周圍組織細(xì)胞,導(dǎo)致纖維化的形成,恰與病理上同階段脂肪組織與纖維組織開始增多相吻合。不同病理時(shí)期相應(yīng)類型巨噬細(xì)胞的出現(xiàn),表明嬰幼兒血管瘤中的巨噬細(xì)胞在微環(huán)境改變下有可能從致增殖的M2型向促消褪的M1型演變,從而實(shí)現(xiàn)功能轉(zhuǎn)化,可見若能通過人為干預(yù),將M2型盡早轉(zhuǎn)化為M1型,勢必加速血管瘤的消褪,進(jìn)而為臨床開啟一有意義的治療途徑。同時(shí)Mantovani和Naito等認(rèn)為巨噬細(xì)胞的功能狀態(tài)存在連續(xù)性,而M1型和M2型巨噬細(xì)胞只是這一連續(xù)狀態(tài)的兩個(gè)極端,其間還有其它類型巨噬細(xì)胞存在,由此我們推測,在嬰幼兒血管瘤病理演變過程中也可能有其它類型巨噬細(xì)胞參與。 本研究利用免疫組化首次探討并證實(shí)了巨噬細(xì)胞存在于嬰幼兒血管瘤增殖與消褪的病理演變過程中,并檢測到增殖和消褪期有相應(yīng)表型出現(xiàn)。這不僅為深入研究巨噬細(xì)胞在嬰幼兒血管瘤中對微血管的生長調(diào)控機(jī)制提供了有意義的依據(jù),而且對于進(jìn)一步了解如何誘導(dǎo)其表型的變化,進(jìn)而應(yīng)用于臨床治療提供了一種有意義的嘗試。 結(jié)論 1.嬰幼兒血管瘤和血管畸形在病理形態(tài)上有著截然不同的表現(xiàn),“分葉狀”病理結(jié)構(gòu)可以作為鑒別診斷兩者的參考指標(biāo)之一；“分葉狀”結(jié)構(gòu)的病理演變過程可能表明嬰幼兒血管瘤的微血管主要來源于血管發(fā)生的結(jié)果；Glut—1可作為鑒別嬰幼兒血管瘤和血管畸形的客觀標(biāo)記,從而剔除血管畸形病例,保證實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本為嬰幼兒血管瘤病例。 2.Ki-67的低表達(dá)可能說明,實(shí)驗(yàn)標(biāo)本代表的這類面積小、生長速度慢和易于切除的嬰幼兒血管瘤病例,增殖活性不高,易于消褪,預(yù)后較好,反而不需要早期積極干預(yù)。 3.巨噬細(xì)胞存在于嬰幼兒血管瘤的各個(gè)時(shí)期,早期出現(xiàn)的為M2型巨噬細(xì)胞,增生晚期和消褪早期出現(xiàn)的為M1型巨噬細(xì)胞。不同病理時(shí)期相應(yīng)類型巨噬細(xì)胞的出現(xiàn),表明嬰幼兒血管瘤中的巨噬細(xì)胞在微環(huán)境改變下有可能從致增殖的M2型向促消褪的M1型演變,從而實(shí)現(xiàn)功能轉(zhuǎn)化。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2160096