發(fā)布時(shí)間：2018-06-08 05:31

  本文選題：皮膚光老化模型 + 脂肪源性干細(xì)胞　； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：皮膚光老化(skin photoaging)是一個(gè)與皮膚損傷有許多病理學(xué)相似點(diǎn)的復(fù)雜過(guò)程,在組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)為膠原成分的減少和彈性纖維變性沉積等皮膚基質(zhì)構(gòu)成成分改變。外在的老化受復(fù)雜的環(huán)境因素調(diào)節(jié),包括吸煙、化學(xué)物質(zhì)暴露和紫外線暴露。UV照射通過(guò)兩個(gè)相互調(diào)節(jié)的通路造成Ⅰ型膠原的減少：刺激膠原的降解和抑制前膠原的合成。因此,UV誘導(dǎo)的Ⅰ型前膠原(Collagen type Ⅰ,COLI)的合成的下降是皮膚光老化病理生理學(xué)中重要因素。研究表明光損傷中最重要的皮膚再生過(guò)程即為膠原重塑,在膠原重塑中成纖維細(xì)胞為最主要的膠原產(chǎn)生細(xì)胞。 現(xiàn)今細(xì)胞治療和激光治療已被廣泛應(yīng)用于光老化皮膚的治療。脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)因其中分泌的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子不僅可以刺激膠原的合成還能促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast, HDF)的遷移,以此治療皮膚光老化。而同樣,CO2點(diǎn)陣激光(carbon deoxide fractional laser)被公認(rèn)為是治,療面部皮膚光老化的“金標(biāo)準(zhǔn)”措施,它通過(guò)局灶性光熱作用原理達(dá)到治療目的,從而改善動(dòng)物模型的光老化。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF-β)作為脂肪源性干細(xì)胞分泌的主要生長(zhǎng)因子能刺激成纖維細(xì)胞增殖,增加包括膠原蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成和分泌。在真皮成纖維細(xì)胞核內(nèi),β連環(huán)蛋白(β-catenin)表達(dá)水平的持續(xù)增高,既可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖與遷移,同時(shí)又可以反饋激活TGF-β信號(hào)通路。已有文獻(xiàn)表明經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的Wnt3a是一類通路胞外配體,它能夠以β-catenin依賴的方式介導(dǎo)Smad2水平升高,進(jìn)而上調(diào)TGF-β表達(dá),促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的分化,從而改善創(chuàng)面愈合情況。同時(shí),也有文獻(xiàn)報(bào)道適時(shí)地激活Wnt信號(hào)通路可以誘使皮膚再生及其附屬器的重建。但是,wnt/β-catenin信號(hào)通路卻很少用于光老化的研究。在ADSCs移植治療皮膚光老化的機(jī)制中發(fā)生作用也并未有過(guò)報(bào)道。 基于以上研究背景,本研究通過(guò)HE染色、VVG染色,COLI免疫組化,真皮厚度的測(cè)量,SOD/MDA酶學(xué)指標(biāo)等驗(yàn)證ADSCs移植與CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療兩種臨床皮膚光老化治療手段的聯(lián)合治療作用。同時(shí)檢測(cè)wnt3a,β-catenin, TGF-β2, COLI在光老化組織及正常皮膚組織中的表達(dá),進(jìn)一步驗(yàn)證激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否參與了脂肪源性干細(xì)胞(adipose derived stem cell,ADSC)治療皮膚光老化的作用過(guò)程。此外通過(guò)體外培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast, HDF)制備皮膚光老化模型,利用ADSC培養(yǎng)上清與HDF共培養(yǎng),同時(shí)在ADSCs培養(yǎng)上清中加入wnt3a抑制劑SFRP2,在細(xì)胞水平檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在其培養(yǎng)前后及加入抑制劑后的表達(dá)水平,探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路是否在脂肪源性干細(xì)胞(adiposederived stem cell,ADSC)促進(jìn)人真皮成纖維細(xì)胞增殖過(guò)程中參與治療皮膚光老化的作用過(guò)程。 一、皮膚光老化模型的制備以及ADSC、CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療 目的:脂肪干細(xì)胞移植治療皮膚老化是國(guó)際前沿技術(shù),應(yīng)用還在摸索階段,而CO2點(diǎn)陣激光被公認(rèn)為是治療面部皮膚光老化的“金標(biāo)準(zhǔn)”措施。兩種治療方法聯(lián)合,運(yùn)用科學(xué)的病例對(duì)照研究、HE、VG染色,COLI免疫組化,真皮厚度的測(cè)量,SOD/MDA酶學(xué)指標(biāo)驗(yàn)證兩種臨床皮膚光老化治療手段及其聯(lián)合作用在病理生理學(xué)角度的效果。 方法：1.酶消化法分離人脂肪源性干細(xì)胞(ADSC)；2.流式細(xì)胞術(shù)鑒定干細(xì)胞標(biāo)志；3.MTT法測(cè)定ADSC細(xì)胞增殖率;4.細(xì)胞成脂、成骨誘導(dǎo)；5.制備大鼠皮膚光老化模型,分5組：①對(duì)照組;②模型組；③ADSCs治療組;④DSCs+CO2點(diǎn)陣激光治療組；⑤C02點(diǎn)陣激光治療組；6.DAPI示蹤14天；7.免疫組織化學(xué)檢測(cè)五組中COLI的分布差異；8.采用HE和VVG染色等病理學(xué)方法檢測(cè)以上各組在治療前后組織形態(tài)學(xué)的變化情況；9.通過(guò)SOD和MDA酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)皮膚抗氧化能力； 結(jié)果：HE染色后可見(jiàn)ADSCs和C02點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療組與模型組相比Ⅰ型膠原纖維增加,真皮淺層出現(xiàn)新生、致密纖細(xì)的膠原纖維,變性卷曲纖維代謝,治療效果最為明顯著。ADSCs和CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療組與單獨(dú)ADSCs注射治療或CO2點(diǎn)陣激光相比真皮厚度增加更為明顯。VVG染色可見(jiàn)與正常組大鼠相比,照射組大鼠膠原纖維含量減少,染色變淺,彈性纖維增多、變粗,部分?jǐn)嗔选⒗p結(jié)。COLI免疫組化結(jié)果可見(jiàn)在ADSCs和C02點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療組中,COLI治療后增加最為明顯,同樣在超氧化物歧化酶(SOD)水平與模型組相比明顯增高,丙二醛(MDA)水平明顯減低。 結(jié)論：依據(jù)病理免疫組化結(jié)果和染色結(jié)果顯示,大鼠光老化模型制備成功,且比較ADSCs單純移植治療組、CO2點(diǎn)陣激光治療組以及ADSCs和CO2點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療組治療效果,聯(lián)合治療組效果最為明顯。驗(yàn)證推論ADSCs注射聯(lián)合CO2點(diǎn)陣激光治療皮膚光老化效果疊加,為光老化的治療提供新的途徑。 二、Wnt/β-catenin信號(hào)通路在光老化皮膚組織治療前后的差異性表達(dá) 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較正常皮膚組織、光老化皮膚和治療后組織中wnt信號(hào)通路中wnt3a、β-catenin是否存在差異表達(dá),以及與TGF-β2的表達(dá)相關(guān)性。探討wnt信號(hào)通路在ADSC治療皮膚光老化過(guò)程中起到的作用及意義。 方法：通過(guò)Q-PCR、Western Blot和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)wnt3a、β-catenin、 TGF-β2在皮膚組織以及模型皮膚組織和治療前后模型組織的表達(dá)。 結(jié)果：Western Blot結(jié)果顯示,wnt3a、β-catenin在皮膚光老化模型組織中表達(dá)量較正常皮膚組織明顯降低,且二者存在顯著性差異(P0.01)。而在ADSCs移植治療組,與模型組組織比較降低的表達(dá)量明顯上調(diào),且與TGF-β2表達(dá)呈正相關(guān),在ADSCs移植和C02點(diǎn)陣激光聯(lián)合治療組上調(diào)的表達(dá)量最為顯著。 結(jié)論：依據(jù)分子和蛋白水平檢測(cè)結(jié)果證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在ADSCs治療皮膚光老化的作用過(guò)程中表達(dá)水平隨之變化。結(jié)合病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果,推測(cè)在ADSCs介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的重建和成纖維細(xì)胞增殖的過(guò)程中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路極有可能參與其中,進(jìn)而促進(jìn)膠原的形成。因此,有望將Wnt/β-catenin信號(hào)通路作為皮膚光老化治療的靶點(diǎn),為皮膚光老化的治療提供新的途徑。 三、下調(diào)wnt3a表達(dá)在ADSCs移植過(guò)程中對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞的影響 目的：研究ASFM對(duì)體外分離的人真皮成纖維細(xì)胞(human dermal fibroblast,HDF)在UVB照射損傷后不同時(shí)間段的保護(hù)作用。經(jīng)過(guò)一系列細(xì)胞、分子、蛋白水平檢測(cè)分析wnt3a表達(dá)下調(diào)對(duì)ADSCs移植治療人真皮成纖維細(xì)胞光老化模型過(guò)程中起到的影響和作用。 方法：制備細(xì)胞光老化模型HDF,收集并制備人脂肪源性干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清(adipose derived stem cells-serum-free culturing medium,ASFM),共培養(yǎng)12h HDF光老化細(xì)胞模型組、共培養(yǎng)24h HDF光老化細(xì)胞模型組、共培養(yǎng)48h HDF光老化細(xì)胞模型組。MTT、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比照射組,ASFM共培養(yǎng)光老化HDF后對(duì)其生長(zhǎng)的改善。Western Blot檢測(cè)ASFM共培養(yǎng)前后光老化HDF中wnt3a、β-catenim TGF-β2、COLI蛋白表達(dá)的變化。以及對(duì)比使用SFPR2(wnt3a拮抗劑)加入ASFM后對(duì)wnt3a的干擾效果,以及對(duì)β-catenin、TGF-β2、COLI蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,共培養(yǎng)ASFM后的HDF光老化模型的細(xì)胞生長(zhǎng)比率明顯高于模型組(P0.05)。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,隨著共培養(yǎng)ASFM12h、24h、48h后,HDF光老化模型中wnt3a、β-catenin、TGF-β2、COLI的蛋白表達(dá)較單純DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HDF模型組逐漸增高。加入SFRP2抑制劑以后,ASFM培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞內(nèi)wnt3a、β-catenin、TGF-β較未干預(yù)組顯著降低。 結(jié)論：wnt/β-catenin信號(hào)參與調(diào)控多種細(xì)胞的增殖、凋亡、分化遷移和粘附。研究發(fā)現(xiàn)wnt3a、β-catenin、TGF-β、COLI在HDF光老化模型中的表達(dá)顯著低于正常HDF。而利用脂肪源性干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清共培養(yǎng)HDF光老化模型后,四種蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。利用wnt3a抑制劑SFRP2干預(yù)wnt3a表達(dá)后,脂肪源性干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)上清共培養(yǎng)HDF光老化模型中β-catenin、TGF-β2、COLI的表達(dá)顯著下調(diào)。提示wnt/β-catenin信號(hào)通路極有可能參與到ADSC移植治療皮膚光老化的機(jī)制中,從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成,包括成纖維細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我們提供了ADSC治療皮膚光老化的新機(jī)制,為再生醫(yī)學(xué)中細(xì)胞治療皮膚光老化提供了的部分依據(jù)。
[Abstract]:Skin photoaging ( skin photoaging ) is a complex process with many pathological similarities to skin damage . It is mainly characterized by the decrease of collagen composition and the change of the composition of skin matrix such as elastic fiber denaturation deposition . The decrease of collagen type I caused by UV irradiation is an important factor in the pathogenesis of photoaging of skin .

Nowadays , cell therapy and laser therapy have been widely used in the treatment of photoaging skin . The cytokines and growth factors secreted by adipose derived stem cells ( ADSCs ) can not only stimulate the synthesis of collagen but also promote the migration of dermal fibroblasts .

Transforming growth factor ( TGF - 尾 ) as the main growth factor secreted by adipose derived stem cells can stimulate the proliferation of fibroblasts and increase the synthesis and secretion of extracellular matrix proteins including collagen .

The expression of Wnt / 尾 - catenin signaling pathway in photoaging and normal skin tissues was investigated .

I . Preparation of skin photoaging model and combination therapy of ADSC and CO2 lattice lasers

Objective : The transplantation of adipose - derived stem cells in the treatment of skin aging is an international precursor technique , and the application of CO2 matrix laser is recognized as a " gold standard " measure for the treatment of photoaging of facial skin . The two methods of treatment combine the scientific case - control study , HE , VG staining , COLI immunohistochemistry , the thickness of the dermis , the SOD / MDA enzymology index to verify the effect of the two clinical skin photoaging treatments and their combined action on the pathologic physiology angle .

Methods : 1 . Human adipose derived stem cells ( ADSCs ) were isolated by enzymatic digestion .
2 . flow cytometry to identify stem cell markers ;
3 . The proliferation rate of ADSC was determined by MTT method .
5 . The rat skin photoaging model was prepared and divided into 5 groups : 鈶，

本文編號(hào)：1994725