發(fā)布時(shí)間：2018-06-04 09:33

  本文選題：毛乳頭細(xì)胞 + P16��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2012年碩士論文

【摘要】：目的：毛囊是毛發(fā)的主體，是一個(gè)典型的再生系統(tǒng)，而毛乳頭細(xì)胞在毛囊發(fā)育和毛囊周期調(diào)控中起主導(dǎo)作用。毛乳頭細(xì)胞是一種特化的成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)毛囊形成是毛乳頭細(xì)胞最為顯著的功能特征，但是體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞只有形成凝集性生長(zhǎng)后才具有誘導(dǎo)毛囊形成的能力。隨著傳代次數(shù)的增加，毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)特性逐漸減弱。 P16基因是一種定位于9p21的多種腫瘤抑制基因，主要有以下幾種名稱：INK4a、CDK4I、CDKN2、MST-1，，其中以INK4a最常見(jiàn)，基因產(chǎn)物P16蛋白屬細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑家族，可對(duì)細(xì)胞周期起到反向調(diào)節(jié)作用，使細(xì)胞生長(zhǎng)到一定時(shí)期后喪失其生物學(xué)特性，出現(xiàn)凋亡反應(yīng)，遏制細(xì)胞的過(guò)度增殖，阻止腫瘤的形成。P16蛋白還參與其它程序的調(diào)控，例如衰老、侵入、血管及紅細(xì)胞的生成和HPV感染等。有研究表明P16蛋白在衰老的成纖維細(xì)胞中呈過(guò)度表達(dá)，其對(duì)成纖維細(xì)胞的衰老有一定的促進(jìn)作用，而毛乳頭細(xì)胞作為一種特化的成纖維細(xì)胞，其P16蛋白的表達(dá)情況目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究P16蛋白在毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)情況，揭示體外培養(yǎng)的人毛乳頭細(xì)胞發(fā)生衰老的可能機(jī)制，研究外源性的P16蛋白對(duì)毛乳頭細(xì)胞的影響，為以后臨床毛發(fā)疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1毛乳頭細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。將改良二步酶消化法獲得的毛乳頭通過(guò)差速離心的方法收集，移入裝有DMEM培養(yǎng)基（15%胎牛，1%雙抗）的培養(yǎng)瓶中，溫箱（5%CO2，37℃）內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。 2毛乳頭細(xì)胞的鑒定、傳代。通過(guò)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色鑒定毛乳頭細(xì)胞。待細(xì)胞融合至70%-80%時(shí)用胰蛋白酶（0.25%）消化傳代，放置溫箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。 3應(yīng)用免疫組化S-P法檢測(cè)不同傳代次數(shù)的毛乳頭細(xì)胞P16蛋白的表達(dá)情況。 4應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同傳代次數(shù)的毛乳頭細(xì)胞P16蛋白的表達(dá)情況。 5MTT分析法檢測(cè)不同濃度的重組人P16蛋白(5ng/ml～200ng/ml)對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的人毛乳頭細(xì)胞衰老的影響。 6應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0，采用單因素方差分析，以α=0.05的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及處理。 結(jié)果： 1應(yīng)用“二步酶消化法”和“差速離心法”，成功分離提取出較純的毛乳頭，貼壁迅速，可見(jiàn)凝集性生長(zhǎng)的特性，3-5代最顯著，7-8代以后完全消失。 2毛乳頭細(xì)胞經(jīng)過(guò)α-SMA（α-平滑肌肌動(dòng)蛋白）免疫組化染色后，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿中含有大量細(xì)絲狀的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。 3免疫組化S-P法檢測(cè)4代、8代細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá)情況。在倒置顯微鏡下可見(jiàn)4代細(xì)胞和8代細(xì)胞胞核P16蛋白表達(dá)分別為極弱陽(yáng)性和弱陽(yáng)性（±），均伴有胞漿弱陽(yáng)性表達(dá)（±），兩組之間有差異�？瞻讓�(duì)照組細(xì)胞胞核胞漿均為陰性表達(dá)（-）。 4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)4代、8代細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá)情況。P16蛋白的表達(dá)量用均道值表示。流式結(jié)果顯示，4代、8代毛乳頭細(xì)胞及陰性對(duì)照組中P16蛋白表達(dá)的均道值分別為-49.32±4.20、-47.38±12.99、-71.51±19.19，蛋白表達(dá)量為負(fù)值，統(tǒng)計(jì)分析顯示各組間均無(wú)顯著性差異(P0.05)。 5MTT檢測(cè)外源性P16蛋白對(duì)毛乳頭細(xì)胞衰老的影響。取5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入不同濃度的重組人P16，培養(yǎng)72h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，未見(jiàn)明顯變化。MTT結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比，在5ng/ml-25ng/ml濃度內(nèi)，促衰老作用呈現(xiàn)劑量依賴性，統(tǒng)計(jì)分析有顯著性差異（P0.05），再增加細(xì)胞因子濃度，促衰老作用反而減弱。 結(jié)論： 1二步酶消化法可快速有效的提取較純的毛乳頭。隨著傳代次數(shù)的增加，毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長(zhǎng)的特性逐漸消失。 2體外培養(yǎng)時(shí)，毛乳頭細(xì)胞中P16蛋白含量極低，隨著傳代次數(shù)的增加，人毛乳頭細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá)量逐漸增加，提示在毛乳頭細(xì)胞的衰老過(guò)程中，P16可能發(fā)揮著較為重要的作用。這也間接證實(shí)了毛乳頭細(xì)胞是一簇特化的成纖維細(xì)胞的觀點(diǎn)。 3外源性的P16蛋白對(duì)毛乳頭細(xì)胞的衰老有促進(jìn)作用，也間接驗(yàn)證了P16可能在毛乳頭細(xì)胞的衰老中發(fā)揮著重要的作用。
[Abstract]:Objective: hair follicle is the main body of hair and is a typical regeneration system, and dermal papilla cells play a leading role in hair follicle development and hair follicle cycle regulation. Hair papilla cells are a special fibroblast, inducing hair follicle formation is the most significant function characteristic of dermal papilla cells, but the cultured dermal papilla cells are only formed in vitro. The ability to induce hair follicle formation was only observed after agglutination. With the increase of passage times, the agglutination growth characteristics of dermal papilla cells gradually weakened.
The P16 gene is a variety of tumor suppressor genes located in 9p21, which mainly include the following names: INK4a, CDK4I, CDKN2, MST-1, which are most common in INK4a. The gene product P16 protein belongs to the cyclin dependent kinase inhibitor family, which can reverse the cell cycle and cause the cell to lose its organism after a certain period of time. Some studies suggest that P16 protein is expressed in senescent fibroblasts, and that P16 protein is expressed in senescent fibroblasts, and has a certain promotion of senescence in fibroblasts. The expression of P16 protein in dermal papilla cells, as a special fibroblast, has not yet been reported. This experiment is to study the expression of P16 protein in dermal papilla cells, to reveal the possible mechanism of aging of human dermal papilla cells in vitro, and to study the effect of exogenous P16 protein on dermal papilla cells. To provide experimental evidence for the treatment of clinical hair diseases.
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本文編號(hào)：1976881