本文選題：阿維A酸 + 黑色素瘤�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2012年碩士論文

【摘要】：目的：惡性黑色素瘤（malignant melanoma, MM）是來源于黑色素細胞的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚，占所有皮膚惡性腫瘤的第三位。其惡性程度高，早期易發(fā)生淋巴和血道轉(zhuǎn)移，愈后差。手術(shù)切除、生物治療、放射治療及化學治療是惡性黑色素瘤通常采用的治療方法，但效果均不理想。隨著早期診斷、外科手術(shù)及輔助治療的發(fā)展，早期患者通過手術(shù)多可以治愈，5年生存率約95%，但進展期患者中生存期僅2-8個月，5年生存率不足5%。傳統(tǒng)化療對惡性黑色素瘤的療效較差，因此，尋求療效好、毒副作用小的新的治療方法和藥物是腫瘤學者研究的熱點問題。 維甲酸類（retinoid）是一組包括維生素A的天然及人工合成的衍生物，具有抗增殖及誘導分化等作用，對多種腫瘤細胞具有抑制作用，是一種有效預防皮膚腫瘤的藥物。其抗皮膚黑色素瘤的機制尚未完全闡明。TNF-a具有廣泛的生物學活性，具有強大的抗腫瘤作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強的細胞因子，但其副作用較大。二者聯(lián)合應用，有可能提高腫瘤對誘導劑的敏感性，增強抗腫瘤作用，從而降低單藥劑量，減少毒副作用，，也可提高治療效果。本研究旨以人黑色素瘤細胞株A375為研究對象，探討維甲酸、TNF-a在不同濃度、不同作用時間對皮膚黑色素瘤細胞增殖抑制作用及形態(tài)分化的影響，篩選兩藥聯(lián)合應用的最佳作用時間和劑量；探討阿維A酸及兩藥聯(lián)合應用對人A375細胞表達MMP-1、TIMP-1的影響。為TNF-a、維甲酸類藥物誘導皮膚腫瘤細胞凋亡的基礎(chǔ)研究及臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法： 1細胞培養(yǎng)將A375惡性黑色素瘤細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml，含鏈霉素100U/ml，PH7.2）中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2采用MTT比色法檢測阿維A酸及阿維A酸聯(lián)合TNF-a對A375細胞增殖的抑制作用。 3倒置相差顯微鏡觀察各組藥物處理后A375細胞的分化及形態(tài)變化。 4應用免疫細胞化學s-p法，檢測不同濃度藥物處理后A375細胞MMP-1、TIMP-1蛋白的表達狀況。 5采用流式細胞分析技術(shù)，檢測A375細胞周期變化和凋亡。 6采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析，以ａ=0.05為顯著性差異標準。 結(jié)果： 1MTT比色分析法檢測各處理因素對人A375細胞增殖的影響（相對抑制率）。 1.1阿維A酸組：濃度不同的阿維A酸組與對照組相比，阿維A酸在0.1umol/L至100umol/L范圍內(nèi)對人黑色素瘤A375細胞有明顯的增值抑制作用，且以100umol/L濃度組作用48h抑制率最高。統(tǒng)計分析表明，在12、24及48三個時間段，阿維A酸對人黑色素瘤細胞A375的抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應關(guān)系和時間依賴效應關(guān)系，各組間差別具有顯著性（p＜0.05）。而10、100μmol/L兩組間比較,其抑制作用差異無統(tǒng)計學意義(P0.05) 1.2阿維A聯(lián)合TNF-a組：將實驗分為3組，分別為陰性對照組（不加任何藥物）TNF-a組(5u/L)及阿維A酸(10umol／L)聯(lián)合TNF-a(5u/L)組。上述各組作用A375細胞48小時后，MTT法檢測實驗組抑制率TNF組為38.60%，聯(lián)合組為58.45%，聯(lián)合組明顯高于對照組11.85%和阿維A酸組43.65%，可見阿維A酸和TNF-a聯(lián)合應用明顯抑制A375細胞增殖，與阿維A酸、TNF-a單獨應用比較，差異具有顯著性（p＜0.05）。 2阿維A酸及阿維A聯(lián)合TNF-a對A375細胞形態(tài)及分化的影響 陰性對照組細胞貼壁生長良好,分布均勻，胞體胞漿飽滿呈棱形、梭形或多角形，透明，折光性好，增殖旺盛；阿維A酸處理A375細胞24小時后，細胞變圓、皺縮、破裂，細胞透亮度和折光性減弱，貼壁差，并且出現(xiàn)細胞漂浮等現(xiàn)象，隨著作用時間的延長上述現(xiàn)象更加明顯；阿維A聯(lián)合TNF-a作用細胞24小時后，細胞形態(tài)變化較單用阿維A更明顯，細胞數(shù)目明顯減少，顯微鏡下可見多量漂浮細胞。 3免疫細胞化學法檢測阿維A酸及阿維A酸聯(lián)合TNF-a作用前后A375細胞MMP-1、TIMP-1蛋白表達情況 MMP-1、TIMP-1蛋白主要表達于細胞漿內(nèi)，DAB染色為棕黃或棕褐色。經(jīng)不同濃度藥物處理后的細胞蛋白陽性表達的程度不同，陰性對照組細胞MMP-1高表達，TIMP-1低表達，在阿維A組及聯(lián)合用藥組A375細胞中，MMP-1及TIMP-1蛋白表達均降低，且聯(lián)合組MMP-1及TIMP-1蛋白表達降低更明顯，差異具有顯著性（p＜0.05）。 4流式細胞術(shù)檢測不同濃度藥物處理后細胞的周期、凋亡變化 流式細胞術(shù)檢測顯示：與對照組相比（28.29%），加藥組（TNF組為38.35%、阿維A酸組為49.56%及聯(lián)合組為58.62%）中處于G0／G1期的細胞百比例明顯增加，而S期（對照組為54.8%、TNF組為42.71%、阿維A酸組為30.5%及聯(lián)合組為22.03%）的細胞數(shù)量明顯減少，各組藥物均能使G1期延滯，G1-S期轉(zhuǎn)化抑制，將細胞阻滯于G0／G1期，且聯(lián)合組效果更明顯。可見，阿維A聯(lián)合TNF-a應用對細胞周期的影響具有協(xié)同作用。TNF-a及阿維A聯(lián)合TNF-a均能誘導A375細胞凋亡，但阿維A聯(lián)合TNF-a誘導A375細胞凋亡作用顯著，差異具有顯著性（p＜0.05）。 結(jié)論： 1阿維A酸和TNF-a都能抑制A375細胞的增殖，并且在一定的濃度和時間范圍內(nèi)，阿維A酸對A375細胞增殖的抑制率具有時間依賴性和量效依賴性。 2阿維A聯(lián)合TNF-a對A375細胞的增殖抑制率優(yōu)于阿維A和TNF-a單用，二者聯(lián)合應用具有協(xié)同作用。 3TNF-a及阿維A酸聯(lián)合TNF-a應用均可阻斷人黑色素瘤細胞A375從G0/G1期進入S期，且聯(lián)合用藥誘導A375細胞凋亡的作用更明顯 4阿維A酸聯(lián)合TNF-a對A375細胞的抑制作用可能與下調(diào)MMP-1、TIMP-1的表達致使MMPs/TIMPs平衡失調(diào)有關(guān)，這可能為其抗腫瘤機理有關(guān)。
[Abstract]:Objective: malignant melanoma (MM) is a malignant tumor derived from melanocytes, which often occurs in the skin and accounts for third of all the malignant tumors of the skin. The malignant degree is high, and the early occurrence of lymphatic and hematogenous metastasis is poor. Surgical resection, biological treatment, radiation therapy and chemical treatment are usually malignant melanoma. With the development of early diagnosis, surgery and adjuvant therapy, the early patients can be cured by operation and the 5 year survival rate is about 95%, but the survival time of the patients in the progressive period is only 2-8 months, and the 5 year survival rate is less than that of the traditional chemotherapy for the malignant melanoma, so the curative effect is better, so the curative effect is better. New therapies and drugs with little toxic side effects are hot topics of oncologists.
Retinoic acid (retinoid) is a natural and synthetic derivative of vitamin A, which has the effect of anti proliferation and induction of differentiation, and has inhibitory effect on a variety of tumor cells. It is an effective drug to prevent skin tumor. Its mechanism of anti skin melanoma has not yet fully elucidated the extensive biological activity of.TNF-a. It has strong anti-tumor effect and is the most antitumor cytokine that has been found so far, but its side effects are great. The combination of the two can improve the sensitivity of the tumor to the inducer, enhance the anti-tumor effect, reduce the dose of the single drug, reduce the side effects and improve the therapeutic effect. This study aims to the human melanoma cells. The effect of retinoic acid, TNF-a at different concentration and time on the proliferation inhibition and morphological differentiation of skin melanoma cells was investigated, and the optimal time and dosage of two drugs combined with two drugs were screened, and the effects of combined application of AVI A acid and two drugs on the expression of MMP-1 and TIMP-1 in human A375 cells were investigated. Basic research and clinical application of formic acid induced apoptosis of skin tumor cells are provided.
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本文編號：1890838