本文選題：沙眼衣原體 + 細(xì)胞培養(yǎng)��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的探討對泌尿生殖道沙眼衣原體臨床株進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)的意義；檢測本地區(qū)近年來泌尿生殖道沙眼衣原體對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類抗菌素的體外藥物敏感性；篩查耐藥株,并從基因水平上探討其耐藥機(jī)制；評(píng)價(jià)藥敏結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性,評(píng)估抗菌素耐藥與臨床治療失敗。 方法培養(yǎng)McCoy細(xì)胞至孔板中,置于37℃、5%CO2溫箱中孵育,18～24h后生長至致密單層后,接種沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株,培養(yǎng)48～72h后,用盧戈氏碘液染色鑒定培養(yǎng)結(jié)果,凡是培養(yǎng)陰性的標(biāo)本繼續(xù)傳代培養(yǎng)至五代。為評(píng)估多次傳代后培養(yǎng)法的敏感性,選用沙眼衣原體內(nèi)源性質(zhì)粒基因片段為引物,PCR擴(kuò)增檢測沙眼衣原體；42株陽性標(biāo)本傳代培養(yǎng)至感染率達(dá)90%以上,收集標(biāo)本進(jìn)行9種常用抗菌素的藥敏試驗(yàn)。核酸擴(kuò)增臨床分離株的omp1基因并用AluⅠ、MspⅠ雙酶切進(jìn)行基因分型。PCR方法擴(kuò)增檢測四環(huán)素耐藥質(zhì)粒tetM基因；同時(shí)用RT-PCR, PCR方法分別擴(kuò)增與大環(huán)內(nèi)酯類耐藥相關(guān)的23S核蛋白體RNA基因、核糖體蛋白基因L4,通過產(chǎn)物測序檢測基因突變；限制性片段分析(RFLP)檢測gyrA喹諾酮耐藥決定區(qū)(Quinolone-Resistance Determining Region, QRDR)常見的基因點(diǎn)突變。統(tǒng)計(jì)方法：試驗(yàn)結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析,確定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算卡方值、相關(guān)系數(shù),確定P值,P0.05即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果299例樣本中細(xì)胞培養(yǎng)法共檢測到104株陽性標(biāo)本,陽性率為34.78%。初次培養(yǎng)(原代)陽性率5.69%,傳代一次后(二代)陽性率為20.07%,傳代兩次后(三代)陽性率為33.44%,傳代三次后(四代)陽性率為34.78%,傳代四次后(五代)陽性率仍為34.78%。前三代隨著傳代,陽性例數(shù)及陽性率明顯增加,而四代、五代基本上處于穩(wěn)定趨勢。PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果除了24例培養(yǎng)法檢測陰性而PCR法檢測為陽性的標(biāo)本外,余與細(xì)胞培養(yǎng)法完全一致。臨床標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)檢測結(jié)果與臨床療效之間存在關(guān)聯(lián)性(χ2=8.242,P=0.0040.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床治療成功的標(biāo)本更易于細(xì)胞培養(yǎng),治療失敗的標(biāo)本不易于細(xì)胞培養(yǎng)檢測,隨著多次傳代培養(yǎng),陽性率明顯增加。藥敏MIC(單位均為mg／L)結(jié)果分別為紅霉素：0.5～2,克拉霉素：0.008～0.032,阿奇霉素：0.125～0.5,四環(huán)素：0.157～0.625,多西環(huán)素：0.063～0.125,米諾環(huán)素：0.032～0.128,左氧氟沙星：0.5～1,莫西沙星：0.06～0.12,司帕沙星：0.064～0.128,其中發(fā)現(xiàn)2株紅霉素耐藥株(MIC值：2mg／L),其23s rRNA基因有C2452A、T2611C的突變(大腸桿菌序列編號(hào)),紅霉素耐藥株及敏感株L4基因均發(fā)現(xiàn)脯氨酸113(CCG)→亮氨酸(CTG)、脯氨酸156(CCC)→丙氨酸(GCC)兩個(gè)位點(diǎn)的突變(GenBank NC000117.1),25株臨床分離株中檢測到tetM基因,未發(fā)現(xiàn)gyrA-QRDR基因中Ser83→Ile點(diǎn)突變。將42株臨床分離株進(jìn)行基因分型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株為D型,余均為E型。 結(jié)論傳代培養(yǎng)可以明顯提高臨床株沙眼衣原體的檢出率,盲傳一次的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)有一定的漏診率,臨床株應(yīng)傳代培養(yǎng)至三代,其培養(yǎng)的成功將為實(shí)驗(yàn)室開展該病原體的致病機(jī)理、免疫機(jī)制、體外藥物敏感性檢測、耐藥機(jī)制和保護(hù)性疫苗等方面的研究奠定基礎(chǔ)。隨著時(shí)間的推移,抗菌素的敏感性呈不同程度的下降,克拉霉素體外抗沙眼衣原體活性最強(qiáng)。米諾環(huán)素,司帕沙星、莫西沙星等均有較強(qiáng)的抗沙眼衣原體感染活性,但其MIC值較以往文獻(xiàn)報(bào)道增高。C2452A、T2611C的突變導(dǎo)致紅霉素低水平耐藥,L4基因的點(diǎn)突變可能與紅霉素耐藥無關(guān),tetM基因陽性率(59.2%)較高,表明體內(nèi)對四環(huán)素敏感性普遍降低。喹諾酮類實(shí)驗(yàn)室突變株可能在臨床株中并不常見。沙眼衣原體對抗菌素的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。E型為沙眼衣原體的優(yōu)勢基因型。以細(xì)胞培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的體外藥敏試驗(yàn)與臨床療效之間存在差異。臨床治療失敗影響培養(yǎng)結(jié)果,沙眼衣原體抗菌素耐藥可引起臨床治療失敗,需要擴(kuò)大樣本量,建立多中心研究進(jìn)一步證實(shí)。
[Abstract]:Objective To investigate the significance of multiple subcultures in the clinical isolates of Chlamydia trachoma of the urinary tract ;
In recent years , the in vitro drug susceptibility of urinary genital trachoma chlamydia to macrolides , tetracycline and quinolone antibiotics has been detected .
The drug resistant strains were screened and the drug resistance mechanism was discussed from the gene level .
To evaluate the correlation between drug sensitivity and clinical efficacy , and to assess the failure of antibiotic resistance and clinical treatment .



Methods The McCoy cells were cultured in porous plate , incubated in incubator at 37 鈩，

本文編號(hào)：1849743