本文選題：HB-13 + P物質(zhì)�。� 參考：《蘭州大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的： (1)體外培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞),以P物質(zhì)刺激,為下一步研究小檗堿衍生物HB-13的抗炎機(jī)制提供體外細(xì)胞模型。 (2)確定小檗堿衍生物HB-13作用于角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)的安全濃度。 (3)研究HB-13對HaCaT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10(IL-10)及干擾素-y (IFN-y)的影響,以期探討HB-13的抗炎機(jī)制。 方法： 第一部分使用DMEM/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞獲贈于西京醫(yī)院皮膚科),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,顯微鏡下觀察細(xì)胞完全貼壁,生長良好時,加入不同藥物濃度(2.5、5、10、20、40、80μg/mL)的小檗堿衍生物HB-13作用于HaCaT細(xì)胞,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法確定HB-13作用于HaCaT細(xì)胞的安全濃度。 第二部分以P物質(zhì)(1×10-8mol/L)刺激HaCaT細(xì)胞,應(yīng)用ELISA法檢測不同時間點(12h、24h、48h)培養(yǎng)上清液中IL-10及IFN-y的含量,檢測體外細(xì)胞模型是否建立成功。 第三部分基于前期的準(zhǔn)備和研究,以P物質(zhì)刺激HaCaT細(xì)胞,加入安全濃度(分別為2.5、5、10μg/mL)的HB-13共孵育12、24、48h,應(yīng)用ELISA法檢測不同時間點培養(yǎng)上清液中IL-10及IFN-y的含量；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測細(xì)胞內(nèi)IL-10及IFN-y蛋白的表達(dá)；同時收集細(xì)胞提取總RNA，，通過熒光定量PCR法檢測不同時間點細(xì)胞內(nèi)IL-1OmRNA及IFN-y mRNA表達(dá)情況。以雷公藤內(nèi)酯醇(T0)作為陽性對照。 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： (1)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)體外培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)果：細(xì)胞呈圓形、橢圓形或梭型及不規(guī)則形狀,與有關(guān)文獻(xiàn)報道相一致； (2)HB-13濃度為2.5、5、10、20、40、80μg/mL時,吸光度值分別為0.982±0.041,0.980±0.043,0.979±0.042,0.728±0.052,0.564±0.053,0.323±0.053；無藥對照細(xì)胞組吸光度值為0.982±0.037；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,HB-13濃度在2.5、5、10μg/mL時,吸光度值與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)；HB-13濃度在20、40、80μg/mL時,吸光度值與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)；提示HB-13濃度在20、40、80μg/mL時對HaCaT細(xì)胞有一定的毒性作用。因此,本研究選擇2.5、5、10μg/mL為HB-13的安全濃度； (3)以P物質(zhì)刺激HaCaT細(xì)胞,分別加入2.5、5、10μg/mL的HB-13共孵育12、24、48h,HB-13可促進(jìn)P物質(zhì)誘導(dǎo)的IL-10的分泌。與對照組雷公藤內(nèi)酯醇(T0)相比,2.5μg/mL的HB-13在12、24h時其促進(jìn)IL-10分泌水平低于To(p0.05)；隨著HB-13濃度增加(5.10μg/mL)及時間的延長,其促進(jìn)IL-10分泌水平明顯高于T0(p0.01)。各組間相比亦有顯著性差異(p0.05)。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IL-10蛋白的表達(dá)水平及熒光定量PCR法檢測IL-10mRNA水平其變化結(jié)果相一致；免疫細(xì)胞化學(xué)示IL-10的在HaCaT細(xì)胞的胞漿中表達(dá),其變化水平與上述檢測水平結(jié)果相一致； (4)細(xì)胞經(jīng)P物質(zhì)刺激后,分別加入2.5、5、10μg/mL的HB-13共孵育12、24、48h，HB-13可促進(jìn)P物質(zhì)誘導(dǎo)的IFN-γ的分泌。與對照組雷公藤內(nèi)酯醇(T0)相比,HB-13促進(jìn)IFN-γ分泌的作用更強(qiáng)(p0.01),但無藥物濃度和作用時間的差異(p0.05)。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ蛋白的表達(dá)水平及熒光定量PCR法檢測IFN-ymRNA水平其變化結(jié)果相一致；免疫細(xì)胞化學(xué)示IFN-γ的在HaCaT細(xì)胞的胞漿中表達(dá),其變化水平與上述檢測水平結(jié)果相一致。結(jié)論： (1)濃度為2.5、5、10μg/mL的小檗堿衍生物HB-13是作用于HaCaT細(xì)胞的安全濃度； (2)HB-13的抗炎作用部分可能是通過促進(jìn)細(xì)胞因子IL-10及IFN-γ的分泌而實現(xiàn)的。
[Abstract]:Objective:
(1) the human immortalized keratinocytes (HaCaT cells) were cultured in vitro, which was stimulated by substance P to provide an in vitro cell model for the study of the anti-inflammatory mechanism of berberine derivative HB-13.
(2) determine the safe concentration of berberine derivative HB-13 acting on keratinocytes (HaCaT).
(3) to study the effect of HB-13 on the secretion of cytokines, interleukin 10 (IL-10) and interferon -y (IFN-y) in HaCaT cells, in order to explore the anti-inflammatory mechanism of HB-13.
Method錛

本文編號：1829002