本文選題：黃芩苷 + 中波紫外線　； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：研究背景和目的: 紫外線(UV)輻射是皮膚癌發(fā)病病因中重要的環(huán)境因素,在相同劑量下,UVB(290-320nm)的光損傷作用比UVA約大800-1000倍,因此日光輻射的致癌效應(yīng)主要?dú)w因于UVB部分。中藥黃芩的主要活性成分黃芩苷是有著廣泛生物學(xué)效應(yīng)的黃酮類抗氧化劑,具有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等作用。本實(shí)驗(yàn)小組既往研究表明黃芩苷能明顯減輕UVB照射引起的小鼠表皮DNA損傷并加速光產(chǎn)物清除,此外外用黃芩苷可拮抗單次大劑量UVB照射造成的紅斑、水腫及真皮炎癥細(xì)胞浸潤,從而提示黃芩苷可能對紫外線誘導(dǎo)的皮膚腫瘤形成具有一定的拮抗作用。然而既往研究均建立在單次UVB照射的條件下,黃芩苷是否對反復(fù)UVB照射造成的小鼠皮膚損傷具有拮抗作用,并且其可能的抗光損傷作用機(jī)制尚未被徹底闡述。COX-2是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶,具有促細(xì)胞增殖作用,參與多種癌前病變和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Ki-67和PCNA與細(xì)胞有絲分裂密切相關(guān),是細(xì)胞周期相關(guān)核抗原,可作為評價細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)。本部分研究以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)對象,參照Katiyar等人以及本研究小組的既往研究,采用180mJ/cm2劑量UVB隔天照射一次、共10次的方法建立反復(fù)UVB照射損傷的動物模型,并外用黃芩苷溶液預(yù)處理背部照射區(qū),采用HE染色、免疫組化及Western blot等多種方法觀察黃芩苷對反復(fù)UVB照射后小鼠表皮厚度、COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表達(dá)的影響,研究其抗光損傷作用的可能機(jī)制。 方法: 1.以6周齡大的雌性C57BL/6小鼠為研究對象,隨機(jī)分為對照組、UVB組、黃芩苷組和黃芩苷+UVB組,其中,UVB組和黃芩苷+UVB組小鼠用180mJ/cm2 UVB照射背部皮膚,隔天1次,共10次;黃芩苷組和黃芩苷+UVB組小鼠于照射前30分鐘在背部預(yù)照射區(qū)涂抹丙酮溶解的黃芩苷溶液(1mg/cm2)。末次UVB照射后24小時處死小鼠,取其背部皮膚以備后續(xù)實(shí)驗(yàn); 2.取小鼠背部皮膚切片,HE染色觀察皮膚病理變化; 3.取小時背部皮膚切片,免疫組織化學(xué)法觀察皮膚組織中COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表達(dá)的變化; 4.取小鼠背部皮膚,分離提取組織總蛋白,Western blot法檢測皮膚組織中COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果: 1黃芩苷減輕UVB照射所致小鼠皮膚病理變化 UVB照射誘導(dǎo)小鼠表皮層厚度增加,約5-8層角質(zhì)形成細(xì)胞厚度,真皮乳頭水腫,局灶性真皮淺血管周圍有以淋巴細(xì)胞為主的單一核細(xì)胞浸潤。黃芩苷可減輕UVB照射引起的組織病理改變,表現(xiàn)為表皮層增厚受抑制,厚度僅3-5層角質(zhì)形成細(xì)胞,真皮層水腫及單核細(xì)胞浸潤減輕; 2黃芩苷降低UVB照射所致COX-2蛋白的表達(dá) 自然狀態(tài)下COX-2在對照組和黃芩苷組組織中呈低水平表達(dá)。UVB照射后COX-2陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加且蛋白表達(dá)水平升高,陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)78.36±13.03%。黃芩苷+UVB組小鼠背部皮膚中COX-2陽性細(xì)胞數(shù)較單純UVB照射組明顯減少且蛋白表達(dá)水平降低,陽性細(xì)胞數(shù)僅為56.30±8.83%。黃芩苷+UVB組中COX-2蛋白表達(dá)水平雖然仍高于對照組,但較UVB組低,與UVB組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示照光前局部使用黃芩苷可抑制UVB照射引起的COX-2蛋白表達(dá)水平增加; 3黃芩苷降低UVB照射所致Ki-67蛋白的表達(dá) 自然狀態(tài)下Ki-67在對照組和黃芩苷組組織中呈低水平表達(dá)。UVB照射后Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加且蛋白表達(dá)水平升高,陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)57.83±9.71%。黃芩苷+UVB組小鼠背部皮膚中Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)較單純UVB照射組明顯減少且蛋白表達(dá)水平降低,陽性細(xì)胞數(shù)僅為38.69±11.76%。黃芩苷+UVB組中Ki-67蛋白表達(dá)水平雖然仍高于對照組,但較UVB組低,與UVB組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示照光前局部使用黃芩苷可抑制UVB照射引起的Ki-67蛋白表達(dá)水平增加; 4黃芩苷降低UVB照射所致PCNA蛋白的表達(dá) 自然狀態(tài)下PCNA在對照組和黃芩苷組組織中呈低水平表達(dá)。UVB照射后PCNA陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加且蛋白表達(dá)水平升高,陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)62.48±8.73%。黃芩苷+UVB組小鼠背部皮膚中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)較單純UVB照射組明顯減少且蛋白表達(dá)水平降低,陽性細(xì)胞數(shù)僅為42.83±10.37%。黃芩苷+UVB組中PCNA蛋白表達(dá)水平雖然仍高于對照組,但較UVB組低,與UVB組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示照光前局部使用黃芩苷可抑制UVB照射引起的PCNA蛋白表達(dá)水平增加。 結(jié)論: 黃芩苷可減輕反復(fù)UVB照射所致的小鼠表皮增厚、水腫及真皮炎細(xì)胞浸潤等損傷,同時降低小鼠表皮中COX-2、Ki-67及PCNA的表達(dá),抑制UVB照射誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。提示黃芩苷可通過抑制UVB誘導(dǎo)的表皮細(xì)胞過度增生而發(fā)揮抗光損傷作用。 研究背景和目的: microRNA(miRNA)是廣泛存在于生命體中的一種正常調(diào)節(jié)機(jī)制,通過與靶mRNA的3’UTR(3’-untranslated region)堿基配對引導(dǎo)基因沉默復(fù)合物(RISC)抑制mRNA翻譯或直接使其降解,使基因在轉(zhuǎn)錄后水平產(chǎn)生沉默,調(diào)控基因表達(dá)。miRNAs參與了動植物許多復(fù)雜的生命過程,包括細(xì)胞發(fā)育、器官生成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及腫瘤形成等。近來環(huán)境致癌物導(dǎo)致生物體miRNA表達(dá)發(fā)生變化的研究屢見報道,然而目前尚無關(guān)于抗光損傷藥物miRNA靶位點(diǎn)的研究報告。發(fā)現(xiàn)并尋找出抗光損傷藥物的核酸靶位點(diǎn),對理解光源性皮膚損傷的發(fā)生機(jī)制有著重要意義,并對開發(fā)防治紫外線光損傷產(chǎn)品具有重要價值。本實(shí)驗(yàn)小組前期工作已在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了黃芩苷可減輕UVB誘導(dǎo)的一系列皮膚光源性損傷,特別是黃芩苷可減少UVB照射后小鼠皮膚及人成纖維細(xì)胞中光產(chǎn)物環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPDs)的產(chǎn)生,并加速其清除。此外我們還用microRNA基因芯片技術(shù)篩選出對照組,UVB組以及黃芩苷+UVB組三組小鼠皮膚中差異表達(dá)的miRNAs,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,UVB照射后小鼠皮膚中miRNA上調(diào)基因3個,下調(diào)基因3個。與UVB組相比,miR-23a是黃芩苷處理后唯一上調(diào)的miRNA,定量PCR方法也驗(yàn)證了芯片檢測結(jié)果。 miR-23a是近年來研究較多的miRNA之一,是一種發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因作用的miRNA。miR-23a作為黃芩苷處理后特異性上調(diào)表達(dá)的miRNA,提示miR-23a可能是參與黃芩苷抗光損傷作用的上游調(diào)節(jié)機(jī)制,然而目前尚無miR-23a在紫外線皮膚光損傷中作用的研究報告。miRNA mimics(模擬物)是根據(jù)成熟的miRNA設(shè)計的雙鏈分子,已完成去保護(hù)、退火和純化等處理過程,為即用型產(chǎn)品,具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。它模擬內(nèi)源成熟miRNA的功能,可以增強(qiáng)內(nèi)源miRNA的沉默作用,用于功能獲得性研究。本實(shí)驗(yàn)中我們采用化學(xué)合成的miR-23a mimics轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞的方法,觀察過表達(dá)miR-23a對急性UVB照射所致皮膚光源性損傷的干預(yù)作用,并采用生物信息學(xué)分析預(yù)測其可能調(diào)控的靶基因,再通過文獻(xiàn)查閱確定其發(fā)揮抗光損傷作用的可能靶基因,最后結(jié)合雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot法通過檢測miR-23a對其靶基因的影響驗(yàn)證生物信息學(xué)的靶基因預(yù)測結(jié)果。 方法: 1.以HaCaT細(xì)胞為研究對象,隨機(jī)分為對照組、UVB組、miR-23a Negative Control(陰性/空載對照)+UVB組和miR-23a mimics +UVB組,利用轉(zhuǎn)染試劑將化學(xué)合成的miR-23a mimics/ Negative Control分別轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞后接受30 mJ/cm2 UVB照射; 2.MTT法檢測HaCaT細(xì)胞增殖活性; 3.流式細(xì)胞儀檢測HaCaT細(xì)胞細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率; 4.免疫熒光法、免疫印跡法檢測HaCaT細(xì)胞中光產(chǎn)物CPDs的清除情況; 5.利用在線數(shù)據(jù)庫targetscan預(yù)測miR-23a可能調(diào)控的下游靶基因,對所有靶基因進(jìn)行基因本體論分析(GO-Analysis)和生物學(xué)通路預(yù)測,并通過文獻(xiàn)檢索選取與光損傷相關(guān)的靶基因拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(Top1)作為進(jìn)一步研究對象; 6.構(gòu)建融合靶基因Top1 3’UTR的雙熒光素酶重組質(zhì)粒,檢測過表達(dá)miR-23a對Top1報告基因熒光素酶活性的影響; 7. Western blot法檢測過表達(dá)miR-23a對UVB照射所致Top1蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果: 1過表達(dá)miR-23a減輕UVB照射對HaCaT細(xì)胞增殖活性的抑制 30 mJ/cm2 UVB照射0、24、48和72小時后HaCaT細(xì)胞增殖活性下降,但轉(zhuǎn)染miR-23a mimics預(yù)處理的HaCaT細(xì)胞在相同劑量UVB照射后的各個觀測時點(diǎn)細(xì)胞增殖活性均明顯高于單純UVB組,提示過表達(dá)miR-23a可減輕UVB照射對細(xì)胞增殖活性的抑制作用; 2過表達(dá)miR-23a減輕UVB照射所致HaCaT細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡 HaCaT細(xì)胞在30 mJ/cm2 UVB照射后24小時大量停留在細(xì)胞周期的S期,即發(fā)生S期阻滯現(xiàn)象,而miR-23a mimics+UVB組S期細(xì)胞數(shù)量較UVB組明顯減少,提示轉(zhuǎn)染miR-23a mimics預(yù)處理可明顯抑制S期阻滯發(fā)生;同時UVB照射后24小時,HaCaT細(xì)胞凋亡率升高至12.94%,說明UVB照射可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡,而miR-23a mimics+UVB組的細(xì)胞凋亡率為僅1.46%,相對單純UVB照射組明顯減少,提示過表達(dá)miR-23a可抑制UVB照射引起的細(xì)胞凋亡; 3過表達(dá)miR-23a加速HaCaT細(xì)胞中UVB照射所致光產(chǎn)物CPDs的清除 HaCaT細(xì)胞經(jīng)30mJ/cm2 UVB照射后,細(xì)胞核內(nèi)立刻開始產(chǎn)生CPDs,在UVB照射后的各個觀測時點(diǎn)(0、2、6和8小時),免疫熒光法和免疫印跡法結(jié)果均顯示miR-23a mimics+UVB組HaCaT細(xì)胞核內(nèi)CPDs的清除速度較單純UVB照射組快,提示過表達(dá)miR-23a可加速HaCaT細(xì)胞中UVB照射所致光產(chǎn)物的清除; 4關(guān)于miR-23a的生物信息學(xué)分析 經(jīng)在線數(shù)據(jù)庫及基因本體論預(yù)測分析顯示miR-23a排在前五位的預(yù)測靶位點(diǎn)是FUT9、ETNK1、RAB39B、KIAA1467和TOP1,它們主要與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA復(fù)制、物質(zhì)代謝以及核苷酸代謝有關(guān)。Top1被預(yù)測是miR-23a調(diào)控的保守靶位點(diǎn)之一,經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)其在DNA修復(fù)中發(fā)揮一定作用; 5過表達(dá)miR-23a降低Top1報告基因的熒光素酶活性 在雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)中,miR-23a mimics和野生型雙熒光素酶重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,Top1報告基因的熒光素酶活性較陰性轉(zhuǎn)染組降低,僅為陰性轉(zhuǎn)染組的45%,說明miR-23a可通過與Top1 3’UTR特異性結(jié)合降低報告基因的熒光素酶活性; 6過表達(dá)miR-23a降低UVB照射后Top1蛋白的表達(dá) UVB照射后Top1蛋白表達(dá)增加,而miR-23a mimics+UVB組Top1蛋白的表達(dá)低于單純UVB照射組,提示轉(zhuǎn)染miR-23a mimics預(yù)處理可抑制UVB誘導(dǎo)的Top1蛋白表達(dá)增加。 結(jié)論: 過表達(dá)miR-23a可減輕UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞生長抑制、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯,并加速光產(chǎn)物CPDs的清除。與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的Top1是miR-23a調(diào)控的靶基因之一,miR-23a通過調(diào)控Top1的表達(dá)發(fā)揮抗紫外線光損傷作用。miR-23a可能成為治療皮膚光源性損傷及光源性皮膚病的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.5

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本文編號：1762754