本文選題：上皮角質(zhì)形成細(xì)胞 + 永生化上皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT��； 參考：《河北聯(lián)合大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：組織工程皮膚模型已應(yīng)用于許多研究中,他們其中的主要目標(biāo)之一是替代動物實(shí)驗(yàn)。目前大多數(shù)皮膚模型是用原代培養(yǎng)的細(xì)胞構(gòu)建的,然而,細(xì)胞的來源有限,每代細(xì)胞之間有很大的差異,因此,皮膚模型的一致性和重復(fù)性很難保證。實(shí)驗(yàn)的主要目的是構(gòu)建兩種皮膚模型來進(jìn)行皮膚刺激性測試。一種皮膚模型利用永生化上皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT構(gòu)建,另外一種皮膚模型利用原代培養(yǎng)的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建。我們根據(jù)歐洲替代實(shí)驗(yàn)確認(rèn)中心規(guī)定的用于皮膚刺激性的物質(zhì)中選取了20種化學(xué)品,在刺激物接觸皮膚模型后,細(xì)胞活力通過MTT測得,然后收集條件培養(yǎng)基檢測IL-1α。兩種皮膚模型具有相似的結(jié)構(gòu)。根據(jù)歐洲替代實(shí)驗(yàn)確認(rèn)中心20種物質(zhì)的檢測結(jié)果顯示兩種模型都適用于進(jìn)行皮膚刺激性檢測,而利用永生化細(xì)胞構(gòu)建的皮膚模型的敏感性和特異性均高于利用原代培養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建的皮膚模型。結(jié)論:兩種皮膚模型均適用于皮膚刺激性的檢測,然而,在皮膚刺激性檢測實(shí)驗(yàn)中含永生化細(xì)胞的皮膚模型具有更好的敏感性和特異性。因此,利用永生化細(xì)胞構(gòu)建的皮膚模型更適合用于皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)分三部分: 第一部分:人原代培養(yǎng)上皮角質(zhì)形成細(xì)胞和永生化上皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT增殖能力的比較 為了篩選適合充當(dāng)組織工程皮膚的種子細(xì)胞,比較原代培養(yǎng)的人原代培養(yǎng)上皮角質(zhì)形成細(xì)胞和永生化的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的增殖能力。比較兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期,細(xì)胞凋亡,生長曲線。結(jié)論:永生化上皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的增殖能力要高于原代培養(yǎng)的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞。 第二部分:利用原代培養(yǎng)的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞和永生化的上皮角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建組織工程皮膚檢測模型 將生長狀態(tài)良好的人成纖維細(xì)胞與小牛Ⅰ型膠原混合,37°C孵育0.5h凝固后,加入培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)10d,取上述真皮基質(zhì)放入24孔培養(yǎng)孔內(nèi),在其表面以5Х106密度接種上皮角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)7d,再進(jìn)行氣液面培養(yǎng)7d,即獲得檢測用的組織工程皮膚模型。利用相同的方法構(gòu)建含永生化上皮角質(zhì)形成細(xì)胞的組織工程皮膚檢測模型。比較兩種模型的形態(tài)學(xué),免疫組化檢測,屏障功能檢測。結(jié)論:兩種模型都適合用于皮膚刺激性檢測。 第三部分:利用構(gòu)建的兩種組織工程皮膚模型進(jìn)行皮膚刺激性檢測 依據(jù)ECVAM規(guī)定的用于皮膚刺激性檢測的物質(zhì)中選取20種物質(zhì)作用于兩種皮膚模型,檢測標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)EpiSkin檢測標(biāo)準(zhǔn),檢測兩種皮膚模型的敏感性和特異性及IL-1α。結(jié)論:含永生化細(xì)胞的組織工程皮膚模型檢測的敏感性和特異性均高于利用原代培養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建的皮膚模型。
[Abstract]:Tissue engineering skin model has been applied in many studies, one of the main goals of them are replacing animal experiments. At present most skin model with primary cultured cells, however, limited cell sources, there are great differences between each generation of cells, therefore, consistency and repeatability of skin model is very difficult guarantee. The main objective of the experiment was to build the skin irritation test of two kinds of skin models. An immortalized keratinocyte cell line HaCaT was constructed by means of the skin model to another model using the original skin keratinocytes. We constructed according to the European Center for alternative experimental verification provisions of the skin irritating substances selected 20 kinds of chemicals, in contact with skin irritants model, cell viability was measured by MTT, and then collected conditioned medium to detect IL-1 alpha two skin model. Has the similar structure. According to the detection results of European substitution experiments confirm the center of 20 substances showed that two kinds of models are suitable for skin irritation test and skin model containing HaCaT cells. The sensitivity and specificity were higher than the primary skin cells to construct the culture model. Conclusion: the two kinds of skin models the applicability of the stimulus to the skin detection, however, is better in the skin to stimulate the skin model containing immortalized cells of the experiment to detect the sensitivity and specificity. Therefore, by means of the skin model of establishing immortalized cells are more suitable for skin irritation.
The experiment is divided into three parts:
The first part: the comparison of primary cultured human keratinocyte cells and immortalized keratinocyte cell proliferation HaCaT
In order to select suitable to act as seed cells of tissue engineering skin. Comparison of primary cultured human primary cultured keratinocyte cells and immortalized keratinocyte cell line HaCaT proliferation. Cell cycle, comparison of two kinds of cell apoptosis, growth curve. Conclusion: immortalized keratinocyte cell line HaCaT proliferation ability than the primary cultured epithelial keratinocytes.
The second part: the use of primary keratinocytes and immortalized keratinocyte model detection of tissue engineering skin cells
The good growth state of human fibroblast and calf collagen mixed 37 ~ C after incubation of 0.5h solidified, cultured with 10d continuous medium, the dermal matrix into the 24 hole culture hole on the surface with 5 * 106 density inoculated epithelial keratinocytes cultured 7d, followed by gas liquid 7d culture, to obtain tissue engineering skin model for detection. To construct immortalized keratinocyte model for detection of tissue engineering skin cells by using the same method. The morphological comparison of two kinds of models, immunohistochemistry, barrier function detection. Conclusion: the two kinds of models are suitable for the skin irritation test.
The third part: using the constructed two tissue engineering skin models to detect skin irritation
According to the ECVAM regulations for skin irritation testing material in selected 20 kinds of substances in two kinds of skin model, according to the EpiSkin standard test standard detection, detection of two kinds of skin models the sensitivity and specificity of IL-1 and alpha. Conclusion: the model of tissue engineering skin containing detection of immortalized cells. The sensitivity and specificity were higher than that of the use of the original skin cell model constructing training.

【學(xué)位授予單位】：河北聯(lián)合大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R751

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本文編號：1760462