本文選題：Stat3 + 氧化石墨烯�。� 參考：《吉林大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：背景：惡性黑色素瘤是一種常見的惡性腫瘤。早期惡性黑色素瘤通過手術(shù)切除，但近年其發(fā)病率有明顯上升趨勢。惡性黑色素瘤具有惡性程度高，轉(zhuǎn)移發(fā)生早，累及多個臟器，預(yù)后較差，易復(fù)發(fā)，死亡率高等特點。目前，大多數(shù)患者對化療、放療均不敏感，生存期短。隨著人們對腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制深入研究，基因治療腫瘤的方法取得了很大進(jìn)步。利用RNA干涉(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，有望特異高效地抑制目的基因表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，達(dá)到治療腫瘤的目的。然而如何將目的基因安全、高效的運載到腫瘤組織內(nèi)，是實現(xiàn)這一目的的瓶頸，近幾年，納米醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展不僅為基因載體的研究提供新手段，而且為惡性腫瘤的診斷和治療帶來新的契機(jī)。因此，迫切需要開發(fā)更具有優(yōu)異性能的納米基因傳遞系統(tǒng)，更好地殺傷腫瘤細(xì)胞。 近幾年，一種極具應(yīng)用前景和優(yōu)異性能的新型納米材料—石墨烯，以其獨特的力學(xué)、電學(xué)、熱學(xué)等理化性質(zhì)引起了研究者極大的興趣。功能化氧化石墨烯（Graphene Oxide, GO）被生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究者廣泛應(yīng)用。迄今，隨著納米技術(shù)的高速發(fā)展，越來越多的實驗證明，經(jīng)過表面修飾的GO可以提高基因的轉(zhuǎn)染效率，在生理環(huán)境下穩(wěn)定性好。聚乙烯亞胺（polythyleneimine, PEI）是目前應(yīng)用較多的陽離子基因傳遞載體，在生理環(huán)境下表面帶正電荷，與基因的結(jié)合能力強(qiáng)，保護(hù)基因免受核酸酶的降解，具有從內(nèi)涵體逃逸的能力。聚乙二醇（PolyethyleneGlycol，PEG）修飾的氧化石墨烯可以提高GO-PEI穩(wěn)定性和溶解性，延長復(fù)合物在體內(nèi)的循環(huán)時間。所以本實驗將采用GO-PEI-PEG反應(yīng)形成的共聚物作為Stat3siRNA質(zhì)粒的運載體。 在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（Signal transducer andactivator of transcription，Stat3）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，在前列腺癌、肝癌及惡性黑色素瘤等多種腫瘤，Stat3呈現(xiàn)過度表達(dá)。Stat3的異常表達(dá)通過促進(jìn)腫瘤新生血管的形成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，參與腫瘤的發(fā)生過程。因此阻斷腫瘤細(xì)胞中Stat3通路，可以達(dá)到治療腫瘤的目的。在實驗室前期工作中，以RNA干涉技術(shù)原理為基礎(chǔ)，成功構(gòu)建Stat3-特異siRNA表達(dá)質(zhì)粒，抑制了前列腺癌、肝癌Stat3基因的過度表達(dá)[1,2]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是，RNAi并不能完全阻斷目的基因的表達(dá)[3]。光熱療在物理學(xué)和生物學(xué)具有獨特的的優(yōu)勢，與放療、化療相比，無毒副作用，具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，可以作為治療腫瘤的一種輔助手段。因此，光熱療和基因治療聯(lián)合策略治療腫瘤迫在眉睫。 本課題將氧化石墨烯、聚乙烯亞胺、聚乙二醇反應(yīng)形成共聚物作為腫瘤基因Stat3-特異siRNA質(zhì)粒的運載體，更好的抑制或殺死腫瘤細(xì)胞。同時利用氧化石墨烯吸收紅外線的物理學(xué)性質(zhì)，在紅外線光照下引起腫瘤組織局部溫度升高，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步探討功能化氧化石墨烯攜帶Stat3-特異siRNA質(zhì)粒對小鼠惡性黑色素瘤的治療效果及作用機(jī)制。 目的：功能化氧化石墨烯攜帶Stat3-特異siRNA表達(dá)質(zhì)粒體內(nèi)、體外抑制小鼠惡性黑色素瘤生長及作用機(jī)制的探討。 方法：采用化學(xué)法合成氧化石墨烯—聚乙烯亞胺—聚乙二醇（GO-PEI-PEG）基因載體。通過原子力學(xué)顯微鏡、動態(tài)光散射等方法，對GO-PEI-PEG粒徑、形貌、表面電勢等進(jìn)行表征；研究GO-PEI-PEG在PBS溶液、血清和培養(yǎng)液中的分散性和穩(wěn)定性。利用瓊脂糖凝膠電泳方法，檢測在不同質(zhì)量比條件下，GO-PEI-PEG與si-Stat3結(jié)合能力。CCK8法檢測GO-PEI-PEG對B16細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞術(shù)評價GO-PEI-PEG運載si-Stat3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。PI染色法檢測腫瘤的細(xì)胞周期。RT-PCR和Western blot檢測Stat3基因及蛋白表達(dá)水平；同時檢測Stat3相關(guān)下游基因的表達(dá)情況。建立C57BL/6小鼠惡性黑色素瘤皮下移植瘤模型。透射電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞以及石墨烯的形貌；免疫組織化學(xué)方法檢測CD34和PCNA的表達(dá)；TUNEL試劑盒檢測腫瘤細(xì)胞凋亡情況；全自動生化分析儀檢測各組小鼠血液中BUN、ALT和AST的水平；HE染色觀察各組臟器的形態(tài)。 結(jié)果：成功合成GO-PEI-PEG納米材料，其表面電勢為＋21.02mV，平均粒徑為298.9nm，GO-PEI-PEG與si-Stat3質(zhì)粒結(jié)合后形成的復(fù)合物，表面電勢下降到＋7.52mV，平均粒徑增大至339.2nm，在PBS溶液、血清和培養(yǎng)液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性。 體外實驗證明，GO-PEI-PEG是一種安全、有效的基因運載體，GO-PEI-PEG攜帶si-Stat3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，能夠觀察到綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)。Westernblot和RT-PCR結(jié)果顯示，GO-PEI-PEG轉(zhuǎn)染si-Stat3組細(xì)胞中Stat3基因被干涉，Stat3下游基因表達(dá)受到抑制。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，GO-PEI-PEG轉(zhuǎn)染si-Stat3組腫瘤細(xì)胞周期阻滯在S期，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。 體內(nèi)實驗證明，GO-PEI-PEG攜帶Stat3-siRNA質(zhì)粒聯(lián)合光照（簡稱GO-si-Stat3組）顯著抑制小鼠惡性黑色素瘤的生長。GO-si-Stat3組的腫瘤瘤重和體積低于其他各組，具有統(tǒng)計學(xué)差異。在基因水平和蛋白水平，檢測到GO-si-Stat3組Stat3表達(dá)受到抑制，Stat3下游調(diào)控基因和相關(guān)蛋白表達(dá)減弱。透射電鏡和HE染色觀察到凋亡細(xì)胞。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，GO-si-Stat3組增殖的腫瘤細(xì)胞減少，微血管生成減少。各組小鼠血液中的BUN、ALT、AST濃度均在正常范圍內(nèi)。HE染色未發(fā)現(xiàn)異常的心、肝、脾、肺、腎形態(tài)。 結(jié)論：功能化氧化石墨烯是一種安全、有效的基因運載體，能夠攜帶Stat3-特異siRNA表達(dá)質(zhì)粒，顯著抑制小鼠惡性黑色素瘤的生長。氧化石墨烯具有吸收紅外線的物理學(xué)性質(zhì)，聯(lián)合紅外線光照，，與Stat3-特異siRNA表達(dá)質(zhì)粒共同發(fā)揮抑制小鼠惡性黑色素瘤生長的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.5

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