本文選題：重癥藥疹　切入點：藥物特異性T細胞　出處：《第四軍醫(yī)大學》2010年碩士論文

【摘要】： 藥疹是一種由藥物引起的不良反應(yīng)。藥物通過口服、注射或吸入等途徑,進入人體內(nèi)而引發(fā)的皮膚或粘膜的炎癥性損害。重癥藥疹是皮膚科常見急癥,其種類繁多,Stevens- Johnson綜合征(Stevens-Johnson Syndrome;SJS)、大皰性表皮壞死松解型藥疹(Toxic Epidermal Necrolysis;TEN)是其中最嚴重的兩種類型,其病情變化快,皮疹廣泛,常伴有高熱,嚴重者會出現(xiàn)全身癥狀及肝腎功能紊亂,此外還伴有大面積表皮內(nèi)大皰,以及皮膚和粘膜的剝脫,具有較高的死亡率。 藥疹的發(fā)病機制尚不明確,近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)重癥藥疹的發(fā)病與免疫學機制有密切的關(guān)系。在對重癥藥疹的研究中,國外相繼發(fā)現(xiàn):①SJS與TEN患者在首次發(fā)生藥物過敏反應(yīng)之后,再次接觸致敏藥物反應(yīng)更迅速,也更強烈,對患者機體的損傷也更為嚴重;②HLA基因在決定患者是否罹患重癥藥疹具有重要作用,HLA-B*1502與卡馬西平、HLA-B*5801與別嘌呤醇導致的重癥藥疹相關(guān);③重癥藥疹患者皮損、水皰內(nèi)含有HLA限制性、具有細胞毒活性的CD8+ T淋巴細胞;④應(yīng)用藥物及其衍生物,可從患者外周血單核細胞(peripheral blood monouclear cells;PBMC)中培養(yǎng)獲得藥物特異性T細胞株和T細胞克隆。上述結(jié)果證實免疫學機制在SJS、TEN發(fā)病中具有關(guān)鍵作用。 大多數(shù)發(fā)疹型藥疹的發(fā)病與細胞免疫密切相關(guān),屬于Th1反應(yīng)優(yōu)勢,IFN-γ是Th1途徑釋放出的主要因子,重癥藥疹也不例外,患者外周血T細胞,受到致敏藥物刺激后,Th1釋放IFN-γ增加。 Fas系統(tǒng)包括Fas、FasL、可溶性FasL。FasL與Fas結(jié)合后能誘導表達Fas的細胞凋亡;Fas及其配體FasL是近年來研究得最為深入的有關(guān)細胞凋亡的膜表面分子。有學者通過FasL激活Fas是導致TEN患者表皮細胞凋亡的第一步。在所有SJS、TEN患者血清內(nèi)的sFasL濃度是明顯升高的,而多形紅斑型藥疹及正常人中sFasL沒有明顯升高。但SJS、TEN之間sFasL并沒有顯著差異。臨床發(fā)病過程分析表明,SJS、TEN患者血清內(nèi)的sFasL,會隨著時間增加而逐漸減少。 在重癥藥疹發(fā)病過程中,有些病人在發(fā)病過程中會產(chǎn)生大小不一的松弛型水皰、大皰,受外力后可形成糜爛面,皮損免疫病理顯示表皮內(nèi)以CD8+細胞占優(yōu)勢,而真皮內(nèi)細胞浸潤則以CD4+細胞占優(yōu)勢。 因此我們決定以T細胞功能為研究對象,通過觀察T細胞功能與藥物刺激的關(guān)系,體外檢測IFN-γ、sFasL分泌水平,不僅可以證明經(jīng)致敏藥物刺激后的T細胞可分泌炎癥因子,從而引起了表皮細胞的損傷;也將有可能應(yīng)用于臨床上重癥藥疹患者致敏藥物的鑒定研究,為臨床醫(yī)師提供可靠的患者致敏藥物判定依據(jù)。 目的: 以重癥藥疹患者藥物特異性T細胞的細胞因子及細胞毒蛋白為研究對象,研究重癥藥疹藥物致敏及損傷表皮的機制,為建立體外致敏藥物檢測方法和開展重癥藥疹的臨床救治工作打下基礎(chǔ)。 方法: 共收集10例重癥藥疹患者(住院患者和治愈后門診隨訪患者),抽取患者外周血分離單個核細胞(PBMC),經(jīng)相應(yīng)的致敏藥物刺激后培養(yǎng)出T細胞株,用ex vivo ELISPOT和Cultured ELISPOT的方法檢測患者PBMC及藥物特異性T細胞株分泌干擾素-γ(interferon-γ;IFN-γ)的情況。對10例患者同時設(shè)立與致敏藥物分子結(jié)構(gòu)不同的無關(guān)藥物對照組。 將經(jīng)致敏藥物刺激后藥物刺激孔上清與HaCaT細胞共培養(yǎng)18h。用光鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測HaCaT細胞凋亡的情況;以及用ELISA的方法,觀察重癥藥疹患者藥物特異性T細胞株上清液中sFasL含量。其中重癥藥疹患者與正常人各10例;經(jīng)檢驗,其流行病學特征與總體樣本無統(tǒng)計學差異;二組年齡差異無統(tǒng)計學意義(p0.05),具有可比性。 結(jié)果: 10例重癥藥疹患者PBMC經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌均明顯高于對照藥物組、正常人對照組及其他類型藥疹組(P0.001)。10例其他類型藥疹中有四例患者PBMC經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌較對照藥物及正常人對照組均略有升高(P0.05)。另外IFN-γ的分泌會隨著與致敏藥物共培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多。 使用相應(yīng)致敏藥物培養(yǎng)出藥物特異性的T細胞株,并采用ELISPOT的方法觀察后發(fā)現(xiàn),藥物特異性T細胞株經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌明顯高于正常人對照及非重癥藥疹組(P0.001)。10例其他類型藥疹中有四例患者T細胞株經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌較對照藥物組及正常人對照組有所升高(P0.05)。SNK-q檢驗分析結(jié)果顯示,PBMC、T細胞株兩組間IFN-γ的分泌有顯著差異(P0.05),經(jīng)藥物刺激后的T細胞株IFN-γ的分泌水平高于PBMC組。 為證明藥物特異性T細胞在患者體內(nèi)長期存在,我們在10例患者中尋找到3例病史為1-3年的患者,同樣發(fā)現(xiàn)其PBMC及T細胞株中均存在藥物特異性T細胞株。 另外,用光鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測中均可以看到加入2%藥物刺激孔上清組,HaCat凋亡明顯多于1%藥物刺激孔上清組;而加入抗FasL的抗體anti-FasL mAb(1μg/mL)后,HaCat細胞凋亡減少。并且,重癥藥疹患者藥物特異性T細胞株上清液中sFasL含量,明顯高于正常人對照組(P0.01)。 結(jié)論: 重癥藥疹患者體內(nèi)存在著藥物特異性T細胞。ex vivo ELISPOT聯(lián)合Cultured ELISPOT方法在體外檢測患者PBMC、T細胞株經(jīng)致敏藥物刺激后產(chǎn)生IFN-γ的分泌水平,可能有助于致敏藥物的鑒定。藥疹患者治愈后體內(nèi)持續(xù)存在藥物特異性的T細胞,這提示患者應(yīng)嚴格避免致敏藥物是的再次服用。 外周血中單個核細胞分泌大量死亡受體的配體sFasL與角質(zhì)細胞中的Fas相結(jié)合,從而導致角質(zhì)形成細胞的凋亡;而阻斷sFasL后角質(zhì)形成細胞凋亡明顯減少,從而說明角質(zhì)形成細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:Drug eruption is a drug - induced adverse reaction . Drugs enter into human body through oral , injection or inhalation route . Severe drug eruption is one of the most serious types . Stevens - Johnson Syndrome ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( Stevens - Johnson Syndrome ; SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type drug eruption ( TEN ) are the most serious types , with severe symptoms and disorder of liver and kidney function .



The pathogenesis of drug eruption is not clear . In recent years , more and more studies have found that the pathogenesis of severe drug eruption is closely related to immunological mechanism .



Most of the rash type drug eruption is closely related to cellular immunity , which belongs to Th1 response advantage . IFN - 緯 is the main factor released by Th1 pathway , and the severe drug eruption is not the exception , and the peripheral blood T cell of the patient is stimulated by the sensitizing drug , and the Th1 release IFN - 緯 increases .



The expression of Fas , FasL , soluble FasL , FasL and Fas combined with Fas could induce the apoptosis of apoptotic cells . Fas and FasL were the first step in the study of apoptosis in TEN patients . The expression of sFasL in serum of all SJS and TEN patients was significantly higher than that in normal controls . However , the sFasL levels in serum of SJS and TEN were not significantly different .



In the course of the onset of severe drug eruption , some patients may develop a loose blister or blister during the course of the disease , which can form erosion surface after external force , and the immune and pathological changes of skin lesions show that CD8 + cells are dominant in the epidermis , while the infiltration of the cells in the dermis is dominated by CD4 + cells .



Therefore , we decided to study the relationship between T cell function and drug stimulation by observing the relationship between T cell function and drug stimulation , and detect the secretion of IFN - 緯 and sFasL in vitro .



Purpose :



In order to establish an in vitro drug - sensitive drug detection method and to carry out the clinical treatment of severe drug eruption , we study the mechanism of drug - specific T - cell and cytotoxic protein of drug - specific T cell in severe drug eruption .



Method :



A total of 10 patients with severe drug eruption ( hospitalized patients and post - cured outpatient follow - up patients ) were collected , and mononuclear cells ( PBMC ) were isolated from peripheral blood of patients . T cell lines were cultured after stimulation with corresponding sensitizing drugs , and IFN - 緯 ( IFN - 緯 ) secretion of PBMC and drug - specific T cell lines was detected by ex vivo ELISA .



The levels of sFasL in the supernatant of drug - specific T cell lines in patients with severe drug eruption were examined by light microscopy , fluorescence microscope and flow cytometry , and the levels of sFasL in the supernatant of drug - specific T cell lines were observed by ELISA .



Results :



IFN - 緯 secretion in PBMCs of 10 patients with severe drug eruption was significantly higher than that of control drug group , normal control group and other types of drug eruption group ( P0.001 ) . The secretion of IFN - 緯 increased slightly in four patients with other types of drug eruption ( P0.05 ) .



The secretion of IFN - 緯 was significantly higher than that of control group and non - serious drug eruption group ( P0.05 ) .



In order to demonstrate the long - term presence of drug - specific T cells in patients , we found 3 patients with a history of 1 - 3 years in 10 patients , and also found that there were drug - specific T cell lines in both PBMC and T cell lines .



In addition , the apoptosis of HaCat cells was significantly higher than that of normal controls ( P0.01 ) .



Conclusion :



In patients with severe drug eruption , there is a drug - specific T - cell in the body of patients with severe drug eruption .



The ligand sFasL secreting a large number of death receptors in peripheral blood is combined with Fas in keratinocytes , which leads to the apoptosis of keratinocytes . The apoptosis of keratinocytes after blocking the sFasL is significantly reduced , which indicates that the keratinocytes play an important role in the process of apoptosis .

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R758.25

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本文編號：1719190