本文選題：NKT細胞　切入點：α-GalCer　出處：《山東大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：衣原體(Chlamydia)是一類專性胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物。沙眼衣原體泌尿生殖道感染是一種常見的性傳播疾病,近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢。女性生殖道沙眼衣原體感染可引起宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等嚴(yán)重并發(fā)癥進而導(dǎo)致不孕和異位妊娠,同時沙眼衣原體感染還能提高HIV感染以及HPV感染所致宮頸癌的機率。以往研究表明在宿主抗衣原體感染過程中,Th1細胞免疫應(yīng)答,尤其是IFN-γ的產(chǎn)生對于宿主抗衣原體感染至關(guān)重要,但是目前對宿主抗衣原體感染的確切免疫機制還缺乏深入了解和認識。闡明衣原體感染過程中免疫保護和免疫病理損傷的機制是研制安全有效衣原體疫苗的首要條件。 自然殺傷T細胞(Natural killer T cells, NKT細胞)是一類獨特的T淋巴細胞亞群,同時表達T細胞和NK細胞的表面典型標(biāo)志。NKT細胞的顯著特點是當(dāng)TCR受到CDld分子遞呈的糖脂抗原的刺激后,能夠迅速活化并產(chǎn)生一系列細胞因子。被激活的NKT細胞還能夠活化其它細胞,如樹突狀細胞、NK細胞、巨噬細胞、B細胞以及T細胞。眾多研究結(jié)果已證明了NKT細胞在自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、腫瘤的轉(zhuǎn)移以及微生物感染中的重要作用,顯示了其強大的免疫調(diào)節(jié)潛能。 NKT細胞能夠識別非經(jīng)典的MHC Ⅰ類分子CDld遞呈的糖脂抗原。α-galactosylceramide (a-GalCer,α-半乳糖神經(jīng)酰胺)是一種海綿生物來源的化合物,可以與CD1d分子特異性結(jié)合,激活具有半恒定TCR的經(jīng)典NKT細胞(以下簡稱為NKT細胞)。相反,擁有多變TCR的非經(jīng)典NKT細胞不能被α-GalCer活化。 大量研究結(jié)果表明NKT細胞在微生物感染中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。研究顯示不同種的衣原體,肺炎衣原體(C. pneumoniae)和鼠型衣原體(C.muridarum),在肺部感染模型中能誘導(dǎo)生成不同的NKT亞群,產(chǎn)生不同的細胞因子模式,從而導(dǎo)致不同的感染結(jié)局。此差異說明了NKT細胞群體作用的復(fù)雜性。要確切的揭示NKT在衣原體感染中的功能還需要更多的實驗室證據(jù)。由于生殖道是沙眼衣原體的天然感染途徑,生殖道又具有不同于呼吸道的特殊免疫微環(huán)境,因而有必要使用小鼠衣原體生殖道感染模型進行進一步的研究。 C. muridarum是沙眼衣原體免疫學(xué)研究中最常使用的衣原體株,它是鼠類的天然病原體,有利于研究病原體與宿主間的關(guān)系。陰道接種C. muridarum后,小鼠感染的病理過程與女性生殖道衣原體急性感染在許多方面非常相似。因此,本研究利用C. muridarum小鼠生殖道感染模型,探討了NKT細胞在衣原體生殖道感染中的作用。由于α-GalCer是NKT細胞的特異性配體,并已被廣泛應(yīng)用于觀察NKT活化后的功能研究,因此我們對α-GalCer刺激的活化NKT細胞在抗C. muridarum生殖道感染中的作用進行了探討。 一、α-GalCer活化NKT細胞在小鼠C. muridarum生殖道感染中的作用 1、α-GalCer能夠增強生殖道局部淋巴結(jié)NKT細胞的活化 首先檢測了α-GalCer對小鼠C. muridarum生殖道感染時NKT細胞活化的影響。雌性BALB/c小鼠注射α-GalCer或者vehicle(溶媒對照)2小時后分別陰道接種衣原體,用四聚體染色方法對兩組小鼠生殖道局部引流淋巴結(jié)NKT細胞的比例進行分析。結(jié)果表明,vehicle對照組小鼠與α-GalCer處理組小鼠的NKT(CDld tetramer+TCRβ+)細胞比例分別是1.55%和5.6%,兩組之間有顯著性差異(p0.001)。 CD69分子的表達,是NKT細胞的一個重要早期活化標(biāo)志。因此,我們通過流式細胞術(shù)檢測了NKT細胞CD69的表達水平,以進一步比較α-GalCer處理組和vehicle對照組小鼠NKT細胞的活化情況。盡管在感染前,NKT細胞已經(jīng)有較高基礎(chǔ)水平CD69的表達,但是感染后,CD69表達水平明顯升高,而α-GalCer能夠進一步上調(diào)衣原體感染局部NKT細胞CD69分子的表達。 2、α-GalCer活化NKT細胞能減輕小鼠C. muridarum生殖道感染和炎癥病理損傷 我們對α-GalCer活化NKT細胞在C. muridarum生殖道感染過程的作用進行了觀察分析。小鼠注射α-GalCer后陰道接種衣原體。感染后檢測小鼠一般狀況和體重變化,并在不同時間點取小鼠陰道拭子檢測衣原體存活數(shù)(IFU)；對小鼠生殖道標(biāo)本進行病理組織學(xué)分析。 重復(fù)實驗結(jié)果表明,與對照組小鼠相比,α-GalCer處理組小鼠一般狀況較好,體重下降較少。自感染第3天開始,α-GalCer處理組小鼠IFU即較對照組輕度減少,第9天時兩組的IFU差異顯著(p0.001)。在整個感染過程中α-GalCer處理組小鼠的陰道衣原體IFU明顯低于對照組存活數(shù)較低(p0.05)。 肉眼生殖道組織大體觀察結(jié)果表明,α-GalCer處理組小鼠較少發(fā)生子宮角擴張和輸卵管積水。鏡下觀察病理組織切片,α-GalCer處理組小鼠的生嬗道局部組織炎癥病變較輕,而對照組小鼠組織中的中性粒細胞等炎性細胞浸潤嚴(yán)重、管腔內(nèi)可見大量的膿性分泌物,可見部分上皮細胞發(fā)生炎性脫落。兩組小鼠局部病變的差異在上生殖道(子宮角和輸卵管)尤為明顯。 上述結(jié)果表明,在小鼠C.muridarum生殖道感染時,α-GalCer活化NKT細胞能夠減輕C. muridarum的生殖道感染和炎性損傷,增強小鼠抗衣原體感染的保護性作用。 二、活化NKT細胞在C. muridarum生殖道感染中發(fā)揮保護性作用的機制 1、C.muridarum生殖道感染能夠誘導(dǎo)局部淋巴結(jié)NKT細胞活化 首先檢測了NKT細胞對C. muridarum生殖道感染的反應(yīng)。收集衣原體感染前和感染后不同時間點的生殖道局部引流淋巴結(jié)單個核細胞,通過免疫熒光染色和流式細胞術(shù)分析NKT細胞的數(shù)量變化,結(jié)果顯示NKT細胞比例在感染后明顯增加。我們還檢測了NKT細胞表面的早期活化標(biāo)志CD69的表達以確定感染后NKT細胞的活化狀態(tài),結(jié)果表明C. muridarum感染后NKT細胞CD69的表達快速上調(diào)。 上述結(jié)果說明C. muridarum生殖道感染可以誘導(dǎo)NKT細胞的活化。 2、C.muridarum生殖道感染能夠誘導(dǎo)NKT細胞功能向IFN-γ方向極化 為闡明C.muridarum生殖道感染時NKT細胞的功能,對NKT細胞分泌細胞因子的模式進行了檢測。生殖道局部淋巴結(jié)細胞內(nèi)細胞因子染色結(jié)果表明,未感染小鼠NKT細胞的IFN-γ和IL-4分泌水平均較低。衣原體感染后,NKT細胞產(chǎn)生的IFN-γ明顯增加,感染前后有顯著差異。盡管感染也促進了IL-4的分泌,但與IFN-y相比仍處于明顯較低的水平。因此,小鼠C.muridarum生殖道感染能夠誘導(dǎo)NKT細胞功能向IFN-γ方向極化。 3、C.muridarum生殖道感染時,α-GalCer促使活化NKT細胞功能進一步向IFN-γ方向極化 通過本論文的第一部分內(nèi)容NKT細胞活化檢測實驗,已經(jīng)證實了α-GalCer能夠促進C. muridarum生殖道感染時NKT細胞的活化。 進一步利用細胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)對NKT細胞產(chǎn)生細胞因子的模式進行檢測。發(fā)現(xiàn)在衣原體生殖道感染時,與vehicle處理組相比,α-GalCer處理組小鼠NKT細胞產(chǎn)生的IFN-γ明顯增加(16%比33%,p0.001)。而兩組小鼠NKT細胞的IL-4分泌均處在較低水平。值得注意的是,單純α-GalCer注射而無衣原體感染組小鼠的NKT細胞分泌IFN-γ和IL-4均明顯增加,展示了與α-GalCer處理合并感染小鼠截然不同的細胞因子模式。因此,α-GalCer處理組小鼠C.muridarum生殖道感染后,NKT細胞功能向IFN-γ方向明顯極化,是衣原體感染誘導(dǎo)了極化作用的產(chǎn)生,α-GalCer處理則進一步加強了此極化作用。 4、NKT細胞活化能夠提高小鼠生殖道局部Thl保護性免疫應(yīng)答 為明確α-GalCer活化NKT細胞增強小鼠抗C.muridarum生殖道感染的保護性作用是否與Thl型免疫反應(yīng)的加強有關(guān),首先對感染小鼠生殖道組織細胞因子的表達進行了檢測。熒光定量PCR結(jié)果表明,與對照組相比,α-GalCer處理小鼠生殖道組織的IFN-γ和IL-12mRNA水平升高,而IL-10水平下降。 隨后用ELISA方法檢測了感染后小鼠的生殖道引流淋巴結(jié)和生殖道沖洗液的細胞因子模式。結(jié)果表明,a-GalCer處理組小鼠感染后局部淋巴結(jié)細胞的IFN-γ分泌水平明顯高于vehicle對照組。盡管細胞因子IFN-γ在生殖道分泌物中的水平要低于淋巴結(jié)細胞,但是α-GalCer處理組和vehicle對照組之間差異仍然明顯(p0.05)。另一細胞因子IL-12p70在α-GalCer處理組小鼠生殖道分泌物和淋巴結(jié)中的表達也明顯增加。IL-10的檢測結(jié)果表明,衣原體生殖道感染后,α-GalCer處理組小鼠產(chǎn)生的IL-10比對照組明顯減少(P0.05)。上述ELISA結(jié)果與熒光定量PCR的檢測結(jié)果吻合。 C.muridarum生殖道感染后局部細胞因子的檢測結(jié)果表明,NKT細胞有利于提高宿主的Th1保護性免疫應(yīng)答反應(yīng)。 5、C.muridarum生殖道感染時,NKT細胞促進NK細胞和T細胞的IFN-γ分泌 研究顯示,NKT細胞TCR受CDld分子遞呈的糖脂抗原的刺激活化后對其它細胞具有活化作用,是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。因此,利用細胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù),檢測了NKT細胞在衣原體生殖道感染過程中對NK細胞和傳統(tǒng)T細胞的調(diào)節(jié)作用。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,α-GalCer處理組小鼠生殖道淋巴結(jié)中NK細胞分泌的IFN-γ顯著增加。同時,α-GalCer處理組小鼠的CD4和CD8T細胞的IFN-γ也明顯增加,而IL-4分泌卻較對照組明顯減少。上述結(jié)果表明NKT細胞活化對NK細胞和T細胞的功能具有調(diào)節(jié)作用,能促進其IFN-y的產(chǎn)生。 綜上所述,本研究首次對NKT細胞在C. muridarum生殖道感染中的作用進行了觀察研究,并對其作用機制進行了初步探討。結(jié)果顯示,經(jīng)特異性配體α-GalCer處理小鼠的生殖道感染和炎癥病理損傷顯著減輕,說明α-GalCer活化NKT細胞對C. muridarum的生殖道感染具有保護性作用。NKT細胞發(fā)揮保護性作用的機制與衣原體生殖道感染誘導(dǎo)NKT細胞活化并向IFN-γ方向極化有關(guān)。NKT細胞增強了宿主抗衣原體生殖道感染的Th1免疫反應(yīng),并對小鼠NK細胞和T細胞有調(diào)節(jié)作用,促進細胞因子IFN-γ的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于我們對沙眼衣原體感染免疫機制的認識,而且可為衣原體感染防治和疫苗研究提供新思路和實驗依據(jù),具有不可低估的科學(xué)應(yīng)用價值。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R759

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王紅楓,劉全忠;沙眼衣原體生殖道感染動物模型的研究進展[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2005年02期

2 陳木開,韓建德,陳小紅,涂裕英;MoPn沙眼衣原體致小鼠生殖道感染模型的初步研究[J];中國人獸共患病雜志;2004年08期

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本文編號：1716383