本文選題：NKT細(xì)胞　切入點(diǎn)：α-GalCer　出處：《山東大學(xué)》2012年博士論文

【摘要】：衣原體(Chlamydia)是一類專性胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物。沙眼衣原體泌尿生殖道感染是一種常見的性傳播疾病,近年來在世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。女性生殖道沙眼衣原體感染可引起宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎等嚴(yán)重并發(fā)癥進(jìn)而導(dǎo)致不孕和異位妊娠,同時(shí)沙眼衣原體感染還能提高HIV感染以及HPV感染所致宮頸癌的機(jī)率。以往研究表明在宿主抗衣原體感染過程中,Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答,尤其是IFN-γ的產(chǎn)生對(duì)于宿主抗衣原體感染至關(guān)重要,但是目前對(duì)宿主抗衣原體感染的確切免疫機(jī)制還缺乏深入了解和認(rèn)識(shí)。闡明衣原體感染過程中免疫保護(hù)和免疫病理?yè)p傷的機(jī)制是研制安全有效衣原體疫苗的首要條件。 自然殺傷T細(xì)胞(Natural killer T cells, NKT細(xì)胞)是一類獨(dú)特的T淋巴細(xì)胞亞群,同時(shí)表達(dá)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的表面典型標(biāo)志。NKT細(xì)胞的顯著特點(diǎn)是當(dāng)TCR受到CDld分子遞呈的糖脂抗原的刺激后,能夠迅速活化并產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子。被激活的NKT細(xì)胞還能夠活化其它細(xì)胞,如樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞以及T細(xì)胞。眾多研究結(jié)果已證明了NKT細(xì)胞在自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、腫瘤的轉(zhuǎn)移以及微生物感染中的重要作用,顯示了其強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)潛能。 NKT細(xì)胞能夠識(shí)別非經(jīng)典的MHC Ⅰ類分子CDld遞呈的糖脂抗原。α-galactosylceramide (a-GalCer,α-半乳糖神經(jīng)酰胺)是一種海綿生物來源的化合物,可以與CD1d分子特異性結(jié)合,激活具有半恒定TCR的經(jīng)典NKT細(xì)胞(以下簡(jiǎn)稱為NKT細(xì)胞)。相反,擁有多變TCR的非經(jīng)典NKT細(xì)胞不能被α-GalCer活化。 大量研究結(jié)果表明NKT細(xì)胞在微生物感染中具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。研究顯示不同種的衣原體,肺炎衣原體(C. pneumoniae)和鼠型衣原體(C.muridarum),在肺部感染模型中能誘導(dǎo)生成不同的NKT亞群,產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子模式,從而導(dǎo)致不同的感染結(jié)局。此差異說明了NKT細(xì)胞群體作用的復(fù)雜性。要確切的揭示NKT在衣原體感染中的功能還需要更多的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。由于生殖道是沙眼衣原體的天然感染途徑,生殖道又具有不同于呼吸道的特殊免疫微環(huán)境,因而有必要使用小鼠衣原體生殖道感染模型進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 C. muridarum是沙眼衣原體免疫學(xué)研究中最常使用的衣原體株,它是鼠類的天然病原體,有利于研究病原體與宿主間的關(guān)系。陰道接種C. muridarum后,小鼠感染的病理過程與女性生殖道衣原體急性感染在許多方面非常相似。因此,本研究利用C. muridarum小鼠生殖道感染模型,探討了NKT細(xì)胞在衣原體生殖道感染中的作用。由于α-GalCer是NKT細(xì)胞的特異性配體,并已被廣泛應(yīng)用于觀察NKT活化后的功能研究,因此我們對(duì)α-GalCer刺激的活化NKT細(xì)胞在抗C. muridarum生殖道感染中的作用進(jìn)行了探討。 一、α-GalCer活化NKT細(xì)胞在小鼠C. muridarum生殖道感染中的作用 1、α-GalCer能夠增強(qiáng)生殖道局部淋巴結(jié)NKT細(xì)胞的活化 首先檢測(cè)了α-GalCer對(duì)小鼠C. muridarum生殖道感染時(shí)NKT細(xì)胞活化的影響。雌性BALB/c小鼠注射α-GalCer或者vehicle(溶媒對(duì)照)2小時(shí)后分別陰道接種衣原體,用四聚體染色方法對(duì)兩組小鼠生殖道局部引流淋巴結(jié)NKT細(xì)胞的比例進(jìn)行分析。結(jié)果表明,vehicle對(duì)照組小鼠與α-GalCer處理組小鼠的NKT(CDld tetramer+TCRβ+)細(xì)胞比例分別是1.55%和5.6%,兩組之間有顯著性差異(p0.001)。 CD69分子的表達(dá),是NKT細(xì)胞的一個(gè)重要早期活化標(biāo)志。因此,我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了NKT細(xì)胞CD69的表達(dá)水平,以進(jìn)一步比較α-GalCer處理組和vehicle對(duì)照組小鼠NKT細(xì)胞的活化情況。盡管在感染前,NKT細(xì)胞已經(jīng)有較高基礎(chǔ)水平CD69的表達(dá),但是感染后,CD69表達(dá)水平明顯升高,而α-GalCer能夠進(jìn)一步上調(diào)衣原體感染局部NKT細(xì)胞CD69分子的表達(dá)。 2、α-GalCer活化NKT細(xì)胞能減輕小鼠C. muridarum生殖道感染和炎癥病理?yè)p傷 我們對(duì)α-GalCer活化NKT細(xì)胞在C. muridarum生殖道感染過程的作用進(jìn)行了觀察分析。小鼠注射α-GalCer后陰道接種衣原體。感染后檢測(cè)小鼠一般狀況和體重變化,并在不同時(shí)間點(diǎn)取小鼠陰道拭子檢測(cè)衣原體存活數(shù)(IFU)；對(duì)小鼠生殖道標(biāo)本進(jìn)行病理組織學(xué)分析。 重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組小鼠相比,α-GalCer處理組小鼠一般狀況較好,體重下降較少。自感染第3天開始,α-GalCer處理組小鼠IFU即較對(duì)照組輕度減少,第9天時(shí)兩組的IFU差異顯著(p0.001)。在整個(gè)感染過程中α-GalCer處理組小鼠的陰道衣原體IFU明顯低于對(duì)照組存活數(shù)較低(p0.05)。 肉眼生殖道組織大體觀察結(jié)果表明,α-GalCer處理組小鼠較少發(fā)生子宮角擴(kuò)張和輸卵管積水。鏡下觀察病理組織切片,α-GalCer處理組小鼠的生嬗道局部組織炎癥病變較輕,而對(duì)照組小鼠組織中的中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重、管腔內(nèi)可見大量的膿性分泌物,可見部分上皮細(xì)胞發(fā)生炎性脫落。兩組小鼠局部病變的差異在上生殖道(子宮角和輸卵管)尤為明顯。 上述結(jié)果表明,在小鼠C.muridarum生殖道感染時(shí),α-GalCer活化NKT細(xì)胞能夠減輕C. muridarum的生殖道感染和炎性損傷,增強(qiáng)小鼠抗衣原體感染的保護(hù)性作用。 二、活化NKT細(xì)胞在C. muridarum生殖道感染中發(fā)揮保護(hù)性作用的機(jī)制 1、C.muridarum生殖道感染能夠誘導(dǎo)局部淋巴結(jié)NKT細(xì)胞活化 首先檢測(cè)了NKT細(xì)胞對(duì)C. muridarum生殖道感染的反應(yīng)。收集衣原體感染前和感染后不同時(shí)間點(diǎn)的生殖道局部引流淋巴結(jié)單個(gè)核細(xì)胞,通過免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析NKT細(xì)胞的數(shù)量變化,結(jié)果顯示NKT細(xì)胞比例在感染后明顯增加。我們還檢測(cè)了NKT細(xì)胞表面的早期活化標(biāo)志CD69的表達(dá)以確定感染后NKT細(xì)胞的活化狀態(tài),結(jié)果表明C. muridarum感染后NKT細(xì)胞CD69的表達(dá)快速上調(diào)。 上述結(jié)果說明C. muridarum生殖道感染可以誘導(dǎo)NKT細(xì)胞的活化。 2、C.muridarum生殖道感染能夠誘導(dǎo)NKT細(xì)胞功能向IFN-γ方向極化 為闡明C.muridarum生殖道感染時(shí)NKT細(xì)胞的功能,對(duì)NKT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的模式進(jìn)行了檢測(cè)。生殖道局部淋巴結(jié)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)果表明,未感染小鼠NKT細(xì)胞的IFN-γ和IL-4分泌水平均較低。衣原體感染后,NKT細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ明顯增加,感染前后有顯著差異。盡管感染也促進(jìn)了IL-4的分泌,但與IFN-y相比仍處于明顯較低的水平。因此,小鼠C.muridarum生殖道感染能夠誘導(dǎo)NKT細(xì)胞功能向IFN-γ方向極化。 3、C.muridarum生殖道感染時(shí),α-GalCer促使活化NKT細(xì)胞功能進(jìn)一步向IFN-γ方向極化 通過本論文的第一部分內(nèi)容NKT細(xì)胞活化檢測(cè)實(shí)驗(yàn),已經(jīng)證實(shí)了α-GalCer能夠促進(jìn)C. muridarum生殖道感染時(shí)NKT細(xì)胞的活化。 進(jìn)一步利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)對(duì)NKT細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的模式進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)在衣原體生殖道感染時(shí),與vehicle處理組相比,α-GalCer處理組小鼠NKT細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ明顯增加(16%比33%,p0.001)。而兩組小鼠NKT細(xì)胞的IL-4分泌均處在較低水平。值得注意的是,單純?chǔ)?GalCer注射而無衣原體感染組小鼠的NKT細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4均明顯增加,展示了與α-GalCer處理合并感染小鼠截然不同的細(xì)胞因子模式。因此,α-GalCer處理組小鼠C.muridarum生殖道感染后,NKT細(xì)胞功能向IFN-γ方向明顯極化,是衣原體感染誘導(dǎo)了極化作用的產(chǎn)生,α-GalCer處理則進(jìn)一步加強(qiáng)了此極化作用。 4、NKT細(xì)胞活化能夠提高小鼠生殖道局部Thl保護(hù)性免疫應(yīng)答 為明確α-GalCer活化NKT細(xì)胞增強(qiáng)小鼠抗C.muridarum生殖道感染的保護(hù)性作用是否與Thl型免疫反應(yīng)的加強(qiáng)有關(guān),首先對(duì)感染小鼠生殖道組織細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。熒光定量PCR結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,α-GalCer處理小鼠生殖道組織的IFN-γ和IL-12mRNA水平升高,而IL-10水平下降。 隨后用ELISA方法檢測(cè)了感染后小鼠的生殖道引流淋巴結(jié)和生殖道沖洗液的細(xì)胞因子模式。結(jié)果表明,a-GalCer處理組小鼠感染后局部淋巴結(jié)細(xì)胞的IFN-γ分泌水平明顯高于vehicle對(duì)照組。盡管細(xì)胞因子IFN-γ在生殖道分泌物中的水平要低于淋巴結(jié)細(xì)胞,但是α-GalCer處理組和vehicle對(duì)照組之間差異仍然明顯(p0.05)。另一細(xì)胞因子IL-12p70在α-GalCer處理組小鼠生殖道分泌物和淋巴結(jié)中的表達(dá)也明顯增加。IL-10的檢測(cè)結(jié)果表明,衣原體生殖道感染后,α-GalCer處理組小鼠產(chǎn)生的IL-10比對(duì)照組明顯減少(P0.05)。上述ELISA結(jié)果與熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果吻合。 C.muridarum生殖道感染后局部細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果表明,NKT細(xì)胞有利于提高宿主的Th1保護(hù)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。 5、C.muridarum生殖道感染時(shí),NKT細(xì)胞促進(jìn)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的IFN-γ分泌 研究顯示,NKT細(xì)胞TCR受CDld分子遞呈的糖脂抗原的刺激活化后對(duì)其它細(xì)胞具有活化作用,是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。因此,利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù),檢測(cè)了NKT細(xì)胞在衣原體生殖道感染過程中對(duì)NK細(xì)胞和傳統(tǒng)T細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,α-GalCer處理組小鼠生殖道淋巴結(jié)中NK細(xì)胞分泌的IFN-γ顯著增加。同時(shí),α-GalCer處理組小鼠的CD4和CD8T細(xì)胞的IFN-γ也明顯增加,而IL-4分泌卻較對(duì)照組明顯減少。上述結(jié)果表明NKT細(xì)胞活化對(duì)NK細(xì)胞和T細(xì)胞的功能具有調(diào)節(jié)作用,能促進(jìn)其IFN-y的產(chǎn)生。 綜上所述,本研究首次對(duì)NKT細(xì)胞在C. muridarum生殖道感染中的作用進(jìn)行了觀察研究,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。結(jié)果顯示,經(jīng)特異性配體α-GalCer處理小鼠的生殖道感染和炎癥病理?yè)p傷顯著減輕,說明α-GalCer活化NKT細(xì)胞對(duì)C. muridarum的生殖道感染具有保護(hù)性作用。NKT細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)性作用的機(jī)制與衣原體生殖道感染誘導(dǎo)NKT細(xì)胞活化并向IFN-γ方向極化有關(guān)。NKT細(xì)胞增強(qiáng)了宿主抗衣原體生殖道感染的Th1免疫反應(yīng),并對(duì)小鼠NK細(xì)胞和T細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)細(xì)胞因子IFN-γ的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)不僅有助于我們對(duì)沙眼衣原體感染免疫機(jī)制的認(rèn)識(shí),而且可為衣原體感染防治和疫苗研究提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù),具有不可低估的科學(xué)應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R759

【參考文獻(xiàn)】

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1 王紅楓,劉全忠;沙眼衣原體生殖道感染動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊(cè);2005年02期

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