發(fā)布時(shí)間：2018-03-25 16:27

  本文選題：白癜風(fēng)　切入點(diǎn)：成纖維細(xì)胞　出處：《江蘇大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:探討在體外將白癜風(fēng)患者白斑患處成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)的可能性,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)及表觀遺傳學(xué)方面的鑒定。方法:(1)獲得白癜風(fēng)患者白斑組織,通過貼壁法取得皮損處成纖維細(xì)胞(vitiligo lesional fibroblast,VLF),包裝含有Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒,感染VLF。在顯微鏡下觀察感染病毒后VLF的形態(tài)變化。誘導(dǎo)至第12天后挑克隆傳代;(2)對(duì)重編程出的細(xì)胞鑒定:堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)干性基因蛋白表達(dá)情況,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)源性干性基因表達(dá)及外源性四因子表達(dá),OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化檢測(cè),染色體核型分析以及畸胎瘤形成分析試驗(yàn)。結(jié)果:1.重編程白癜風(fēng)患者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(1)重編程過程中第4天開始出現(xiàn)ES樣克隆細(xì)胞,并且隨培養(yǎng)天數(shù)增加長大,有自我生長能力;(2)傳代后的VP-i PS(vitiligo patient specific-induced pluripotent stem cell,VP-i PS cell)細(xì)胞形狀規(guī)則,細(xì)胞核排列緊密,細(xì)胞可見很高的核質(zhì)比。2.鑒定白癜風(fēng)患者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(1)AP染色顯示VP-i PS細(xì)胞為未分化狀態(tài);(2)細(xì)胞免疫熒光顯示干性基因OCT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4蛋白水平表達(dá)陽性;(3)q RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性干性基因Oct4、Sox2、Nanog、h TERT、Rex1、DNMT3B、GDF3,與陰性對(duì)照比較表達(dá)水平顯著升高(P0.05),檢測(cè)外源性四因子基因與陽性對(duì)照比較表達(dá)水平顯著下降(P0.05);(4)重亞硫酸鹽測(cè)序顯示VP-i PS細(xì)胞OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)槿ゼ谆癄顟B(tài),VLF細(xì)胞則為甲基化狀態(tài);(5)染色體核型分析顯示VP-i PS細(xì)胞核型正常,未出現(xiàn)缺失等情況;(6)VP-i PS細(xì)胞可以在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤,具備向三個(gè)胚層分化的能力。結(jié)論:可以在體外將白癜風(fēng)患者白斑患處成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞,并且具備干細(xì)胞表觀遺傳學(xué)特征及功能,為進(jìn)一步研究干細(xì)胞治療和白癜風(fēng)提供了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: To investigate the in vitro skin fibroblasts of patients with vitiligo leukoplakia reprogrammed into induced pluripotent stem cells (induced pluripotent stem cells, I PSCs) the possibility, and the morphology and apparent identification of genetics. Methods: (1) vitiligo patients get leukoplakia lesions, made fibroblasts by adherent method (vitiligo lesional fibroblast, VLF), Sox2, packaging containing Oct4, Klf4, c-Myc four transcription factor retrovirus, observe the morphological changes of VLF after infection under the microscope. VLF. infection induced twelfth days to pick cloning passage; (2) the identification of the cell reprogramming: alkaline phosphatase (alkaline phosphatase, AP) staining. The expression of stemness gene protein immunofluorescence detection, real-time PCR to detect the expressions of endogenous and exogenous gene expression of dry four factor, the promoter region of OCT4 gene Methylation detection, karyotype analysis and analysis of the formation of teratoma test. Results: 1. patients with vitiligo reprogramming induced pluripotent stem cells (1) reprogramming process appeared fourth days ES like clone cells, and increased with the days of culture grew up, self growth ability; (2) VP-i PS (after passage vitiligo patient specific-induced pluripotent stem cell, VP-i PS cell) cell shapes and nucleus cells arranged closely, high nucleocytoplasmic ratio.2. identification of patients with vitiligo induced pluripotent stem cells (1) AP VP-i PS staining showed that the cells in an undifferentiated state; (2) immunofluorescence indicated that dry gene OCT4, NANOG, TRA-1-60. The expression level of SSEA4 protein; (3) Q RT-PCR detection of endogenous dry gene Oct4, Sox2, Nanog, h, TERT, Rex1, DNMT3B, GDF3, expression level was significantly increased compared with the negative (P0.05), detection of exogenous factor four Compared with the positive control of gene expression level was significantly decreased (P0.05); (4) bisulfite sequencing analysis showed that VP-i PS cell OCT4 gene promoter region methylation, the methylation status of VLF cells is; (5) the chromosome karyotype analysis showed that VP-i PS cells did not appear to lack normal karyotype, etc.; (6) VP-i PS cells can form teratomas in NOD/SCID mice and have the capability to three differentiation. Conclusion: Patients with vitiligo leukoplakia affected area in vitro reprogramming of fibroblasts into induced pluripotent stem cells, stem cells and have epigenetic features and functions, provide the basis for further study of stem cell therapy and vitiligo.

【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.41

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本文編號(hào)：1663967