本文選題：丙型肝炎抗體　切入點(diǎn)：梅毒抗體　出處：《廣州醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景丙型肝炎和梅毒是常見血液傳播性疾病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染可造成急性或慢性肝炎,會發(fā)展為肝硬化或肝癌。梅毒螺旋體(Treponema Pallidum,TP)感染可損害人體多系統(tǒng)多器官,導(dǎo)致組織破壞、功能喪失,甚至危及生命,并能母嬰傳播,威脅下一代健康。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)報(bào)告,丙肝和梅毒發(fā)病率呈逐年上升趨勢,現(xiàn)已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。目前尚無能預(yù)防HCV和TP感染的有效疫苗。這兩種疾病感染初期往往無明顯的臨床癥狀和體征,易造成漏診,延遲治療。實(shí)驗(yàn)室結(jié)果作為主要臨床診斷指標(biāo),結(jié)果準(zhǔn)確對臨床診療與阻斷疾病的傳播具有重要意義。近年來,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)因其通量大、自動化程度高、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于無癥狀人群的篩查和疾病診斷。但許多研究表明,ELIA和CLIA兩種篩查試驗(yàn)均存在一定比例的假陽性,尤其在低感染流行人群中會出現(xiàn)較高的假陽性。假陽性結(jié)果會帶給受檢者不必要的就醫(yī)和心理傷害,需要引起重視。影響產(chǎn)生假陽性的因素目前尚不明確。不同檢測方法的假陽性率不同,這可能與方法使用的反應(yīng)體系、抗原成分和抗原表位等有關(guān)。TP47蛋白是梅毒螺旋體中豐度最高、抗原性強(qiáng)和特異性高的抗原,是用于檢測梅毒特異性抗體的主要抗原之一。研究報(bào)道,TP47中有一段與人纖維連接蛋白有較高的同源性的序列,這可能和某些自身免疫性病人血清與梅毒檢測試劑發(fā)生交叉反應(yīng)有關(guān)。利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測特異性抗原表位,去掉特異性差的片段,降低引起交叉反應(yīng)的可能性。這種抗原表位的應(yīng)用可能會降低假陽性反應(yīng),提高檢測方法的特異性。研究目的1.探討Architect i2000和HISCL 5000兩種化學(xué)發(fā)光方法檢測抗HCV抗體(Hepatitis C virus antibody,Anti-HCV)和抗TP抗體(Treponema Pallidum antibody,Anti-TP)灰區(qū)標(biāo)本的假陽性結(jié)果情況,為HCV和TP的診斷和治療提供應(yīng)用參考。2.建立TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的雙抗原夾心ELISA,比較兩方法檢測梅毒抗體的敏感性和特異性,探索利用抗原表位解決假陽性問題方案的可行性。研究方法1.收集本院Architect i2000檢測Anti-HCV篩查陽性結(jié)果(1≤S/CO≤5)的樣本161例。全部樣本均進(jìn)行HISCL 5000檢測。以高敏HCV核酸(Ribonucleic acid,RNA)定量和重組免疫印跡試驗(yàn)(Recombinant immune blot assay,RIBA)的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)確定真、假陽性。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.收集本院Architect i2000檢測Anti-TP篩查陽性結(jié)果(1≤S/CO≤10)的樣本334例。全部樣本均進(jìn)行HISCL 5000檢測和梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(Treponema Pallidum particle agglutination assay,TPPA)檢測。兩種化學(xué)發(fā)光方法檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行RIBA檢測。以TPPA和RIBA的結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)確定真、假陽性。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.利用EMBOSS、Bepipred和IEDB預(yù)測軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測。根據(jù)上述預(yù)測軟件的結(jié)果,選取TP47的81-120的氨基酸序列作為優(yōu)勢抗原表位,應(yīng)用基因工程技術(shù),構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28b-TP47E,重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定,并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和層析柱純化和免疫印跡法(Western Blot,WB)鑒定。4.采用過碘酸鈉法標(biāo)記重組蛋白作酶標(biāo)抗原,以重組蛋白作包被抗原,建立雙抗原夾心ELISA,優(yōu)化抗原包被濃度、包被方式、封閉條件、血清稀釋倍數(shù)、血清反應(yīng)時間、酶標(biāo)抗原濃度、酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間和底物反應(yīng)時間等條件,并檢測46份TPPA陰性血清和91份Architect i2000檢測結(jié)果處于灰區(qū)的標(biāo)本(1≤S/CO≤10),比較TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的雙抗原夾心ELISA的敏感性和特異性。研究結(jié)果1.HISCL檢測Anti-HCV結(jié)果陽性的標(biāo)本有23例,陰性的有138例,兩化學(xué)發(fā)光法的Anti-HCV結(jié)果一致率為14.3%(23/161)。所有標(biāo)本的HCV RNA定量檢測結(jié)果均陰性。RIBA檢測13例結(jié)果陽性,45例不確定,103例陰性。Architect和HISCL與RIBA的總一致率分別為8.1%(13/161)和69.6%(112/161),Architect假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的91.9%(148/161);HISCL假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的52.2%(12/23)。HISCL方法檢測的標(biāo)本RIBA陽性組、不確定組和陰性組的平均COI值分別為3.0、1.0和0.2,三組間的COI值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0000.01);Architect方法檢測的標(biāo)本RIBA陽性組、不確定組和陰性組的平均COI值分別2.8、2.2和2.0,三組間的S/CO值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0270.05)。2.HISCL檢測Anti-TP結(jié)果陽性的標(biāo)本有209例,陰性的有125例,兩化學(xué)發(fā)光法的Anti-TP結(jié)果一致率為62.6%(209/334)。以TPPA為標(biāo)準(zhǔn),Architect和HISCL的結(jié)果與TPPA的總一致率分別為61.7%(206/334)和85.3%(285/334)。Architect假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的38.3%(128/334);HISCL假陽性標(biāo)本占其總陽性標(biāo)本的12.4%(26/209)。TPPA陽性組和陰性組的Architect平均S/CO值、HISCL平均COI值分別為4.8和2.5、3.9和0.8,兩組間的S/CO值或COI值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P=0.0000.01)。Architect陽性而HISCL陰性的125例標(biāo)本經(jīng)RIBA檢測,6.4%標(biāo)本陽性(8/125),26.4%不確定(33/125),67.2%陰性(84/125)。3.綜合分析B細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果,選取TP47位于81-120的氨基酸序列作為優(yōu)勢抗原表位,標(biāo)記為TP47E,其氨基酸序列為AFRQQFQYAVEVLGEK VLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSV。PCR擴(kuò)增獲得編碼TP47E蛋白的基因序列,構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET28b-TP47E,測序結(jié)果表明,其堿基序列與Gen Bank中的基因序列一致,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、鎳離子親和層析柱純化和免疫印跡法獲得了重組TP47E抗原表位蛋白。4.采用過碘酸鈉法標(biāo)記重組蛋白,獲得酶標(biāo)抗原�；赥P47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白建立的雙抗原夾心ELISA,其最佳抗原包被濃度分別為1μg/mL和0.5μg/mL、最佳包被方式為37℃2h后4℃過夜,最佳封閉條件為1%BSA和4℃過夜,最佳血清稀釋度為血清原液,最佳血清反應(yīng)時間為90min,最佳酶標(biāo)抗原濃度為1μg/mL,最佳酶標(biāo)抗原反應(yīng)時間為30min,最佳底物反應(yīng)時間為10min。TP47E的ELISA法的敏感性和特異性為81.3%(47/58)和94.0%(31/33),TP47的ELISA法的敏感性和特異性為93.2%(55/59)和78.8%(26/33)。結(jié)論1.Architect i2000和HISCL 5000兩種化學(xué)發(fā)光法檢測Anti-HCV和Anti-TP的灰區(qū)標(biāo)本均出現(xiàn)較高假陽性,假陽性原因還需進(jìn)一步深入研究,迫切需要研發(fā)特異性更高的Anti-HCV和Anti-TP的實(shí)驗(yàn)室篩查方法。2.本文成功建立了TP47E抗原表位和TP47全蛋白的雙抗原夾心ELISA方法并比較兩者的敏感性和特異性。TP47E抗原表位ELISA方法的敏感性不足,但與TP47全蛋白比較,明顯提高了檢測的特異性,初步顯示通過優(yōu)化抗原能提高檢測特異性。
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【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R759.1;R446.6;R512.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1605764