本文選題：逆向性痤瘡　切入點(diǎn)：全基因組外顯子測序　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2012年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景逆向性痤瘡(Inversa acne,AI)又名化膿性汗腺炎，是一種少見的常染色體顯性遺傳病，以反復(fù)發(fā)生皮膚膿腫、竇道及瘢痕形成為特征性表現(xiàn)。起初該病被認(rèn)為與頂泌汗腺有關(guān)，直至1990年，Yu和Cook表明導(dǎo)致本病的始動(dòng)因素是毛囊的閉塞。目前認(rèn)為，該病是由于毛囊漏斗部的上皮細(xì)胞過度增生造成毛囊口及皮脂腺的阻塞，皮質(zhì)排出不暢，激發(fā)細(xì)菌感染引起。遺傳因素是最主要的病因，環(huán)境及內(nèi)分泌等其它因素在該病的發(fā)病中也起著重要作用。AI通常好發(fā)于腋窩、腹股溝及臀部等大汗腺分布部位，初起為堅(jiān)實(shí)的疼痛性炎性結(jié)節(jié)，以后可出現(xiàn)波動(dòng)感、膿腫破裂、流膿和形成竇道。實(shí)驗(yàn)室檢查往往發(fā)現(xiàn)貧血、血沉加快，血清類風(fēng)濕因子陰性。AI常伴發(fā)聚合性痤瘡和膿腫性穿鑿性頭部毛囊周圍炎，統(tǒng)稱為毛囊閉鎖三聯(lián)征；除皮損外，本病還可伴發(fā)關(guān)節(jié)炎或者繼發(fā)鱗狀上皮細(xì)胞癌，不僅對患者的健康和美觀均有極大影響，而且可造成患者嚴(yán)重的身心負(fù)擔(dān)。逆向性痤瘡全球發(fā)病率為1-4%，一般發(fā)生于青春期后，大多數(shù)病例在20-30歲時(shí)發(fā)病，平均發(fā)病年齡為23歲。本病多發(fā)生于女性，女性與男性的發(fā)病比率為3.3:1.14。本病有家族性群發(fā)現(xiàn)象，可表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳，亦可為散發(fā)。2006年,本實(shí)驗(yàn)室在一個(gè)四代中國漢族人家系中將該病的致病基因定位于染色體1p21.1—1q25.3區(qū)域，但是沒有發(fā)現(xiàn)該病的致病基因。除此之外，染色體6q25.1—25.5和9p12—13.11也被提出與AI相關(guān)。Werth和Williams指出AI可能是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病可能與幾個(gè)基因相關(guān)。目前，對單基因疾病致病基因的搜尋多采用定位克隆的方式，然而，該方法耗時(shí)較長且定位區(qū)域一般較大，往往不能直接找到疾病的致病基因。最近，全基因組外顯子測序被成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的致病基因，如Freeman Sheldon綜合癥的MYH3基因，Miller綜合征的DHODH基因和Schinzel-Giedion綜合征的SETBP1基因。該方法已被證明為降低稀有單基因疾病候選基因甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段。 目的(1)通過全基因組外顯子測序發(fā)現(xiàn)逆向性痤瘡的候選致病基因。(2)通過對候選致病基因進(jìn)行驗(yàn)證，，明確逆向性痤瘡的致病基因。(3)通過比較該致病基因在病例和對照之間表達(dá)水平的差異，探索其在逆向性痤瘡發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法(1)為了更有效的篩選候選基因，選擇之前通過全基因組連鎖分析將逆向性痤瘡的致病基因定位于染色體1p21.1—1q25.3區(qū)域的家系(家系I)進(jìn)行初篩研究。對家系I的兩名病例(Ⅱ4和Ⅲ11)和1名家系內(nèi)對照(Ⅲ10)進(jìn)行全基因組外顯子測序。(2)通過a.過濾掉同義突變等不影響基因功能的突變，只保留非同義突變、剪切位點(diǎn)突變等影響基因功能的突變；b.過濾掉公共遺傳突變數(shù)據(jù)庫(dbSNP)正常人攜帶的常見突變、已發(fā)表的正常對照個(gè)體的突變、以及該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)測序的正常對照個(gè)體的突變；然后在所有患病個(gè)體的突變集合中取交集；減少候選致病突變的數(shù)量。(3)通過候選致病區(qū)域染色體1p21.1—1q25.3過濾，進(jìn)一步減少候選致病突變的數(shù)量，并利用軟件預(yù)測突變對蛋白功能的影響進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)逆向性痤瘡可能的致病突變/基因(4)用PCR測序方法，在初篩家系(家系I)中驗(yàn)證通過全基因組外顯子測序發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，觀測該突變是否導(dǎo)致了疾病表型的發(fā)生。(5)通過PCR測序方法，在其他家系(家系Ⅱ)的患者中檢驗(yàn)候選致病基因的所有外顯子中是否發(fā)生功能性突變；之后，在更大范圍的正常人群中驗(yàn)證在前兩步中發(fā)現(xiàn)的存在于候選致病基因中的所有功能突變。(6)采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法，從mRNA水平檢測致病基因在逆向性痤瘡患者和正常對照外周血單個(gè)核細(xì)胞中是否存在表達(dá)差異。 結(jié)果(1)經(jīng)過全基因組外顯子測序后，初篩家系兩名病例(Ⅱ4和Ⅲ11)和一名家系內(nèi)對照(Ⅲ10)測到的總SNPs數(shù)分別為：41,177，44,660和42,196個(gè)。(2)過濾掉同義突變等不影響基因功能的突變和公共遺傳突變數(shù)據(jù)庫(dbSNP)正常人攜帶的常見突變、已發(fā)表的正常對照個(gè)體的突變、以及該項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)測序的正常對照個(gè)體(Ⅲ10)的突變后，Ⅱ4和Ⅲ11所剩余的突變位點(diǎn)分別為：227和203個(gè)；隨后，兩名患者Ⅱ4和Ⅲ11的突變位點(diǎn)取交集，所剩余的突變位點(diǎn)為85個(gè)。(3)在候選區(qū)域染色體1p21.1—1q25.3內(nèi)對上述85個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)一步過濾，剩余的突變位點(diǎn)還有8個(gè)，分別位于以下8個(gè)基因內(nèi)：MYBPHL, KCNC4, FLAD1, NES, NCSTN,ITLN2, SLC9A11和Clorf220。利用ANNOVAR和GERP等軟件預(yù)測突變對蛋白功能的影響進(jìn)一步篩選后，發(fā)現(xiàn)位于NCSTN基因的c.1352+1GA剪切位點(diǎn)突變最有可能為初篩家系(家系I)的致病突變。(4)用PCR測序方法，對突變位點(diǎn)NCSTN c.1352+1GA在家系I內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證，觀測到該突變導(dǎo)致了家系I患者逆向性痤瘡的發(fā)病。(5)通過PCR測序方法，在其他家系(家系Ⅱ)的患者中檢測到候選致病基因NCSTN的第3號(hào)外顯子存在一個(gè)2個(gè)核苷酸的缺失c.210_211delAG。家系內(nèi)所有對照均不存在該突變。前兩步發(fā)現(xiàn)的存在于候選致病基因NCSTN中的兩個(gè)功能突變于90名正常人中通過PCR測序方法驗(yàn)證后也不存在。(6)與正常人相比，NCSTN mRNA在逆向性痤瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)降低。 結(jié)論本研究采用最先進(jìn)的全基因組外顯子測序方法，成功發(fā)現(xiàn)了逆向性痤瘡的致病基因NCSTN，在此基礎(chǔ)上，通過NCSTN mRNA表達(dá)研究表明γ-分泌酶亞單位基因NCSTN單倍劑量不足可能為家族性逆向性痤瘡某種亞型的遺傳學(xué)發(fā)病基礎(chǔ)。而且，研究結(jié)果提示出γ-分泌酶—Notch通路可能參與了家族性逆向性痤瘡的分子學(xué)發(fā)病機(jī)制。除此之外，本研究進(jìn)一步證實(shí)了全基因組外顯子測序?yàn)橐环N發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病致病基因有力、有效的方法。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R758.733

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 徐薇,趙俊英,趙繪,顧菲,黃笑鳴;毛囊閉鎖性三聯(lián)征一例及家系分析[J];中華皮膚科雜志;2005年03期

本文編號(hào)：1594091