本文關(guān)鍵詞： 5-氨基酮戊酸光動力療法 原卟啉Ⅸ 皮膚鱗狀細胞癌 動物模型 療效 細胞死亡 微血管密度 免疫學效應(yīng)　出處：《揚州大學》2012年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的 研究5-氨基酮戊酸光動力療法(5-aminolevulinic acid photodynamic therapy,ALA-PDT)對紫外線所致SKH-1無毛小鼠皮膚鱗狀細胞癌簡稱鱗癌(squamous cell carcinoma,SCC)的治療效果,并從細胞死亡方式、腫瘤微血管損傷和部分免疫學效應(yīng)等方面系統(tǒng)探討ALA-PDT的作用機制。 方法 1.以紫外線照射,構(gòu)建SKH-1無毛小鼠多發(fā)性皮膚鱗癌,瘤體直徑長至1～5mm后選取55只荷瘤小鼠將其隨機分為ALA-PDT治療組(15只)即A組、單純涂ALA組(15只)即B組、單純照射紅光組(15只)即C組、空白對照組(10只)即D組。另外選擇9只荷瘤小鼠隨機平均分為三組,分別給予5%、8%、16%ALA霜劑外涂,采用curalux熒光檢測儀連續(xù)監(jiān)測12h的PpⅨ熒光強度,確定最佳敷藥濃度及最佳治療時間。A組小鼠以上述確定的最佳濃度和敷藥時間,給以632.8nm紅光(輸出功率20mw/cm2,劑量30J/cm2)照射,B組小鼠給予同樣濃度的ALA敷藥但不照光,C組不給予ALA敷藥,但以同樣劑量的紅光照射,D組不作任何處理。各組每周治療1次,共4次,每次治療前測量腫瘤的長徑和短徑,計算腫瘤體積,計數(shù)瘤體數(shù)目并稱量小鼠體重,直至治療結(jié)束后2周；當小鼠死亡或有腫瘤體積達500mm3時該小鼠即停止研究,計算各組小鼠平均荷瘤生存率。 2.另選取21只直徑1～5mm荷瘤小鼠,分別于ALA-PDT治療前及首次治療后1h、3h、6h、12h、24h和7d各時間點隨機選擇3只小鼠,麻醉后處死取腫瘤組織,每塊組織平均分為兩部分,一半以2.5%戊二醛固定保存,制作電鏡標本,一半以4%多聚甲醛固定保存,制作常規(guī)病理切片,以透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)和光學顯微鏡觀察治療前后不同時間點腫瘤組織形態(tài)學變化。 3.取上述時間點的腫瘤組織切片,采用TUNEL細胞凋亡檢測法檢測治療后24h內(nèi)細胞凋亡情況,采用免疫組織化學技術(shù)檢測各時間點LC3B、CD34、CD4、CD8、CDla的表達,觀察細胞自噬形成、微血管密度及局部免疫效應(yīng)變化。 結(jié)果 1.末次治療后2周,A組即ALA-PDT組具有明顯的抑制腫瘤生長作用,與治療前相比腫瘤體積明顯縮小(P0.05),直徑1～4mm和(或)厚度2.5mm瘤體可完全消失,直徑4～5mm和(或)厚度≥2.5mm可部分消失或緩解；而B、C、D三組則沒有抑制腫瘤生長的作用,與治療前相比腫瘤體積不斷增大(P0.05)；治療后A組與其他各組相比,體積顯著縮小(P0.01)。隨著治療次數(shù)的增加,A組瘤體逐漸減少,但是停止治療后1-2周,瘤體數(shù)目不再減少也未增多,但個別未消失瘤體開始增大；其余三組小鼠瘤體數(shù)目則逐漸增多可達十余枚,部分小鼠背部瘤體融合成片或者呈地毯式分布。 2.實驗研究期間除了A組以外,B、C、D組各有4-5只小鼠腫瘤體積達500mm3以上均給予麻醉后脫頸椎處死。余小鼠均存活至實驗結(jié)束,D組1只小鼠因意外死亡,A組小鼠荷瘤生存率較其他三組差異顯著(χ2=8.374,p=0.0390.05)。治療前后各組小鼠體重均無明顯差異(P0.05)。 3.組織病理檢查結(jié)果：治療前腫瘤細胞密集分布,核大深染,異型性明顯,腫瘤間質(zhì)毛細血管豐富。ALA-PDT治療后：1h腫瘤血管充血,其內(nèi)可見少量炎性細胞；3h時血管內(nèi)大量炎性細胞粘附于血管壁,向血管外組織中移行,腫瘤細胞間水腫；6h組織間彌漫性滲血,血管內(nèi)血栓形成,血管閉塞,周邊部分腫瘤組織壞死呈灶狀紅色均染,并且有大量的炎癥細胞(中性粒細胞等)浸潤；12h仍有滲血,組織空隙有塊狀淤積的紅細胞,；24h淤血有所緩解,腫瘤細胞壞死可見片狀紅色淡染區(qū),伴有炎性細胞浸潤；至治療后第7d大面積的腫瘤壞死,局部大量的炎性細胞浸潤,中性粒細胞碎裂可見大量核塵。 4.TEM超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)：治療前腫瘤細胞呈多角形,核漿比例大,核仁多,細胞表面有較多的微絨毛,未見凋亡和壞死的細胞。ALA-PDT治療后1h細胞腫脹,微絨毛減少,線粒體腫脹并開始出現(xiàn)空泡,還可見皺縮變小的凋亡前期細胞；3h可見核染色質(zhì)邊集呈環(huán)狀,胞漿開始出芽脫落形成凋亡小體；6h胞質(zhì)進一步空泡化,細胞松散連接不緊密；12h胞質(zhì)高度空泡化,仍可見凋亡細胞,核邊集,但后期能量不足,包漿破裂,繼發(fā)形成壞死；24h細胞完全壞死,結(jié)構(gòu)消失成模糊片狀。 5. TUNEL:PDT治療后3h開始出現(xiàn)凋亡細胞,隨著時間的延長細胞凋亡逐漸增加,但是各時間點差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 6.免疫組化研究結(jié)果：ALA-PDT治療后,CD34表達逐漸降低,從治療后6h開始與治療前相比,血管密度明顯降低(P0.05),12h以后血管損傷更加嚴重,血管顯著減少(P0.000),治療后第7d,腫瘤間質(zhì)毛細血管消失,僅見皮下結(jié)締組織中1-2條小動脈。CDla蛋白陽性樹突狀細胞數(shù)在治療前及治療后1h、3h、6h、12h時比較無明顯差異(P0.05),治療后24h、7d與治療前相比表達增高(P0.05)；與治療前相比CD4、CD8陽性T細胞數(shù)在治療后7d明顯增多(P0.05)；CDla與CD4和CD8陽性細胞數(shù)具有明顯的線性關(guān)系,呈正相關(guān),r值分別為0.884,0.862,P值均0.05；CD34與CDla、CD4+T、CD8+T細胞呈負相關(guān),r值分別為-0.923、-0.847、-0.85,P值均0.05。LC3陽性細胞數(shù)在治療后0.5h、1h、3h、24h及7d升高,與治療前相比差異具有顯著性(P0.05)。 結(jié)論 1.4次ALA-PDT治療能夠有效清除直徑1～4mm和(或)厚度小于2.5mm SCC,抑制直徑4mm以上(或)厚度為2.5～3mm瘤體的生長速度,提高小鼠的荷瘤生存率； 2. ALA-PDT能夠通過細胞壞死和凋亡兩種方式直接殺傷鱗癌細胞,以細胞壞死為主要細胞死亡方式； 3. ALA-PDT可損傷鱗癌組織微血管內(nèi)皮細胞,使血流淤積血栓形成,阻斷了鱗癌組織的血液供應(yīng),間接殺滅鱗癌細胞； 4. ALA-PDT殺傷腫瘤細胞后能夠誘導(dǎo)中性粒細胞、DCs以及CD4+T、CD8+T細胞聚集,增強局部免疫學效應(yīng)； 5.本研究顯示腫瘤細胞沒有通過自噬的方式死亡,推測自噬可能產(chǎn)生于巨噬細胞,參與了免疫學效應(yīng)。
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【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：1541668