本文關(guān)鍵詞： 惡性黑色素瘤 細(xì)絲蛋白A 表皮生長(zhǎng)因子受體 核增殖抗原Ki-67 增殖 轉(zhuǎn)移　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 多種因素影響惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括環(huán)境因素、遺傳因素和種族因素等都扮演重要角色。大量臨床、流行病學(xué)及遺傳學(xué)研究揭示，惡性黑色素瘤屬于異質(zhì)性腫瘤，包含多種基因突變類型，可在陽光暴露程度不同的身體多部位發(fā)病，提示其發(fā)生受多致病因素影響。利用現(xiàn)代先進(jìn)的基因檢測(cè)技術(shù)，深入研究惡性黑色素瘤發(fā)病的分子機(jī)制，將有助于判斷疾病預(yù)后和選擇最佳治療方案。 表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor，EGF）和表皮生長(zhǎng)因子受體（Epidermal growth factor receptor， EGFR）是參與正常細(xì)胞和異常細(xì)胞分裂、增殖、遷移和存活的關(guān)鍵分子。EGFR與配體結(jié)合后可發(fā)生同源或異源二聚體化，導(dǎo)致其胞內(nèi)段受體酪氨酸激酶發(fā)生自身磷酸化，主要通過ERK、Akt和JNK通路傳導(dǎo)活化信號(hào)。當(dāng)其異常活化或降解抑制時(shí)，可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生。有研究證明，許多人類腫瘤中均過表達(dá)EGFR，且EGFR的表達(dá)水平與治療反應(yīng)不佳、疾病惡化及存活率低相關(guān)。 細(xì)絲蛋白A（Filamin A，F(xiàn)LNa）是第一個(gè)在非肌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白。其可形成同源二聚體，與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)構(gòu)成動(dòng)態(tài)三維立體結(jié)構(gòu)。FLNa作為腳手架可錨定90余種伴侶分子，其中包括多種細(xì)胞膜受體，調(diào)控諸如細(xì)胞形狀、細(xì)胞移動(dòng)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能和生理過程。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生不僅與EGFR持續(xù)活化、蛋白降解抑制有關(guān)，并且與FLNa構(gòu)成的復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，可由于FLNa異常表達(dá)影響其與伴侶錨定聯(lián)接，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。盡管已證實(shí)FLNa與導(dǎo)致惡性腫瘤的信號(hào)異常有關(guān)，但其具體機(jī)制仍有待研究。 我們利用不表達(dá)FLNa的人惡性黑色素瘤M2細(xì)胞株和經(jīng)FLNa基因轉(zhuǎn)染M2細(xì)胞獲得的穩(wěn)定表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然M2細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)量明顯高于M2A7細(xì)胞，但經(jīng)EGF刺激后EGFR磷酸化的量卻明顯少于M2A7細(xì)胞。此結(jié)果提示，EGFR表達(dá)量的多少并不代表其活化程度，可能還有其它因素調(diào)控著EGFR的活化，臨床上不能僅僅根據(jù)EGFR的表達(dá)量來評(píng)價(jià)腫瘤患者的預(yù)后，研究調(diào)控EGFR活化的新機(jī)制具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。 為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，改變?nèi)藧盒院谏亓黾?xì)胞FLNa的表達(dá)水平，觀察FLNa表達(dá)變化對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響；接種裸鼠，觀察FLNa表達(dá)變化對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞成瘤能力的影響；通過蛋白印跡（western blot）及免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）檢測(cè)FLNa表達(dá)變化對(duì)EGFR及其下游信號(hào)磷酸化水平的影響；收集臨床資料，觀察人惡性黑色素瘤組織中FLNa表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。以期揭示FLNa與惡性黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為FLNa成為惡性黑色素瘤臨床診斷參考指標(biāo)和基因治療新靶點(diǎn)等提供理論依據(jù)。 方法： 1FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞株增殖、遷移及侵襲的影響 體外培養(yǎng)不表達(dá)FLNa的人惡性黑色素瘤M2細(xì)胞及其穩(wěn)定表達(dá)FLNa的亞克隆M2A7細(xì)胞；將表達(dá)FLNa-shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達(dá)FLNa的人惡性黑色素瘤UACC647細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞，利用western blot驗(yàn)證沉默效果。 1.1體外檢測(cè)FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖能力的影響 利用MTT法體外檢測(cè)FLNa對(duì)細(xì)胞活力的影響。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分別接種于96孔板，血清饑餓4小時(shí)后，加入不同濃度EGF（4,20,100nM）培養(yǎng)44小時(shí)，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，加入DMSO振蕩溶解后置于酶標(biāo)儀570nm處檢測(cè)OD值。 利用平板克隆法體外檢測(cè)FLNa對(duì)細(xì)胞貼壁后克隆形成的影響。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞吹打混勻?yàn)閱渭?xì)胞懸液后分別接種于35mm培養(yǎng)皿，在含1%或10%胎牛血清培養(yǎng)基及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周，蘇木素染色后，鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)量。 利用軟瓊脂克隆法體外檢測(cè)FLNa對(duì)細(xì)胞非錨定增殖的影響。用含0.35%低熔點(diǎn)瓊脂糖的培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液后，分別接種于預(yù)先鋪有含0.6%瓊脂糖培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板，在含1%或10%胎牛血清及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周，鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆形成數(shù)量。 1.2利用劃痕法體外檢測(cè)FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞遷移的影響 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板并饑餓培養(yǎng)4小時(shí)。使用無菌移液器吸頭在單層細(xì)胞上均勻劃痕，漂洗脫落細(xì)胞。無或加入EGF（20nM）繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)觀察并拍照記錄至劃痕愈合，以劃痕初始寬度為1計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)相對(duì)寬度值。 1.3利用Transwell小室法體外檢測(cè)FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞侵襲的影響 預(yù)饑餓的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分別置于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清MEM或1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，上室未穿膜細(xì)胞用棉簽擦去，已穿膜細(xì)胞用甲醇固定、HE染色，光鏡觀察并拍照計(jì)數(shù)。 2FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞EGFR信號(hào)通路分子的影響 預(yù)饑餓細(xì)胞分別接受EGF（20nM）刺激0、5、10、30分鐘，加入蛋白裂解液提取總蛋白。將等濃度等體積蛋白樣本經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。利用3%牛血清白蛋白或5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，分別加入抗磷酸化酪氨酸、EGFR、磷酸化ERK、總ERK和-actin等一抗，4C過夜，次日加入相應(yīng)二抗，曝光顯影，使用ImageJ軟件定量分析蛋白條帶灰度值。 裂解實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，向蛋白裂解液分別加入小鼠抗EGFR抗體和小鼠IgG于4C過夜?jié)L動(dòng)混勻。次日加入蛋白G瓊脂糖微珠滾動(dòng)混勻。漂洗微珠后，經(jīng)加熱獲取洗脫液，用抗磷酸化酪氨酸抗體進(jìn)行western blot檢測(cè)。 3FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞裸鼠體內(nèi)成瘤的影響 將UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞分別接種于5周齡雌性BALB/c裸鼠右后肢。成瘤后每周2次測(cè)量瘤體直徑并稱重。4周后處死裸鼠，剝?nèi)×鼋M織并稱重拍照。提取瘤組織總蛋白，利用western blot檢測(cè)不同瘤組織EGFR磷酸化水平。石蠟包埋瘤組織，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FLNa及Ki-67表達(dá)。兩位病理學(xué)家獨(dú)立判斷FLNa和Ki-67的表達(dá)情況。采用H指數(shù)法半定量分析FLNa表達(dá)；統(tǒng)計(jì)500個(gè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Ki-67表達(dá)情況，計(jì)算其陽性表達(dá)率。 4FLNa和Ki-67在人惡性黑色素瘤組織中的表達(dá) 從白求恩國(guó)際和平醫(yī)院病理科選取30例惡性黑色素瘤組織標(biāo)本，采用免疫組化計(jì)數(shù)分別檢測(cè)FLNa和Ki-67的表達(dá)情況，并分析FLNa的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果： 1FLNa促進(jìn)人惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲 通過穩(wěn)定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)得到沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞株。蛋白印跡法檢測(cè)，與親本細(xì)胞組及陰性對(duì)照組相比，UACC647(KD)細(xì)胞FLNa的表達(dá)被抑制70%以上。 通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，在不同濃度EGF（4nM，20nM，100nM）刺激下，與不表達(dá)FLNa的M2細(xì)胞相比，表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞均展示出更高的增殖能力；但是在無EGF刺激情況下，，兩者增殖能力基本相同。類似的是，隨著將UACC647細(xì)胞FLNa沉默表達(dá)，在有或無EGF刺激下，其增殖能力均有所降低。平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)均顯示，在EGF刺激下，F(xiàn)LNa表達(dá)水平較高的M2A7和UACC647(ctrl)細(xì)胞形成克隆的能力均強(qiáng)于FLNa表達(dá)水平較低的M2和UACC647(KD)細(xì)胞。 通過劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，在有或無EGF刺激下，高表達(dá)FLNa的M2A7和UACC647(ctrl)細(xì)胞遷移能力均強(qiáng)于相應(yīng)低表達(dá)FLNa的M2和UACC647(KD)細(xì)胞；其中在EGF刺激下，劃痕后12小時(shí)M2A7細(xì)胞的劃痕相對(duì)寬度值為0，而M2細(xì)胞劃痕相對(duì)寬度值為0.58±0.03；劃痕后15小時(shí)UACC647(ctrl)細(xì)胞的劃痕相對(duì)寬度值為0，而UACC647(KD)細(xì)胞劃痕相對(duì)寬度值為0.51±0.01。 通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，與M2細(xì)胞相比，表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞穿透Matrigel基質(zhì)膠的侵襲能力約是其1.9倍(P 0.01)。與此一致的是，沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞的侵襲能力較UACC647(ctrl)細(xì)胞降低了1.8倍(P 0.01)。 2FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞配體誘導(dǎo)的EGFR信號(hào)通路的影響 通過Western blot檢測(cè)，雖然不表達(dá)FLNa的M2細(xì)胞表達(dá)更多的EGFR，但EGF刺激后磷酸化EGFR水平卻明顯低于表達(dá)FLNa的M2A7細(xì)胞。后續(xù)進(jìn)行的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果。檢測(cè)EGFR下游信號(hào)通路中ERK磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)在EGF刺激下，M2A7細(xì)胞中磷酸化ERK水平明顯高于M2細(xì)胞。在UACC647(ctrl)細(xì)胞和沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)也得到一致的結(jié)果，隨著FLNa表達(dá)水平降低，EGF引起的EGFR和ERK磷酸化水平明顯下降，與UACC647(ctrl)細(xì)胞相比，EGF刺激10分鐘后，UACC647(KD)細(xì)胞磷酸化EGFR比率降低了70%。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞中EGFR磷酸化水平的區(qū)別。與UACC647(ctrl)細(xì)胞相比，沉默F(xiàn)LNa導(dǎo)致EGF引起的UACC647(KD)細(xì)胞磷酸化ERK比率顯著降低1.4倍。由此推斷， FLNa可增強(qiáng)EGF刺激引起的EGFR酪氨酸磷酸化水平，并活化其下游Ras-Raf-MEK-ERK通路。 3FLNa促進(jìn)人惡性黑色素瘤細(xì)胞裸鼠種植瘤生長(zhǎng) 通過在裸鼠皮下接種UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細(xì)胞檢測(cè)FLNa對(duì)人惡性黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響。與UACC647(ctrl)相比，沉默F(xiàn)LNa表達(dá)的UACC647(KD)細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)明顯減慢。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)顯示，在UACC647(ctrl)細(xì)胞形成的腫瘤組織中可見彌漫、深染的Ki-67沉著于胞核，而強(qiáng)陽性表達(dá)的FLNa信號(hào)分布于胞漿。與此相反的是， UACC647(KD)細(xì)胞形成的瘤組織中僅有弱陽性Ki-67和FLNa表達(dá)。經(jīng)線性統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)LNa的H指數(shù)為64.33±10.59，且與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.88; P 0.01）。western blot檢測(cè)顯示，UACC647(KD)細(xì)胞所形成的腫瘤組織中磷酸化EGFR和ERK所占比率分別下降80%和46%。上述結(jié)果支持沉默F(xiàn)LNa抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞體外、體內(nèi)增殖的觀點(diǎn)。 4FLNa低表達(dá)預(yù)示惡性黑色素瘤患者較好預(yù)后 經(jīng)兩位病理學(xué)家獨(dú)立分析判斷，30例惡性黑色素瘤標(biāo)本中FLNa表達(dá)的H指數(shù)為69.77±5.17。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)LNa表達(dá)與Ki-67表達(dá)正相關(guān)（r=0.60; P 0.01），而與總生存期呈負(fù)相關(guān)（r=-0.45; P=0.013）。選取H指數(shù)中位數(shù)分組，高表達(dá)FLNa組患者的總生存期明顯縮短（中位生存期為594天），顯著低于而低表達(dá)FLNa組患者（中位生存期為1949天；P=0.0011）。然而，本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)FLNa表達(dá)與患者年齡、性別和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。 結(jié)論： 1增加或沉默F(xiàn)LNa的表達(dá)可增強(qiáng)或抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力。 2沉默F(xiàn)LNa表達(dá)可抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤生長(zhǎng)。 3FLNa可通過增強(qiáng)EGF誘導(dǎo)的EGFR活化（磷酸化）及其下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。 4惡性黑色素瘤患者腫瘤組織中FLNa表達(dá)水平與Ki-67呈正相關(guān)，與總生存期呈負(fù)相關(guān)；FLNa低表達(dá)預(yù)示惡性黑色素瘤患者預(yù)后較好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1491486