本文關(guān)鍵詞： 惡性黑色素瘤 細絲蛋白A 表皮生長因子受體 核增殖抗原Ki-67 增殖 轉(zhuǎn)移　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 多種因素影響惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括環(huán)境因素、遺傳因素和種族因素等都扮演重要角色。大量臨床、流行病學(xué)及遺傳學(xué)研究揭示，惡性黑色素瘤屬于異質(zhì)性腫瘤，包含多種基因突變類型，可在陽光暴露程度不同的身體多部位發(fā)病，提示其發(fā)生受多致病因素影響。利用現(xiàn)代先進的基因檢測技術(shù)，深入研究惡性黑色素瘤發(fā)病的分子機制，將有助于判斷疾病預(yù)后和選擇最佳治療方案。 表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor， EGFR）是參與正常細胞和異常細胞分裂、增殖、遷移和存活的關(guān)鍵分子。EGFR與配體結(jié)合后可發(fā)生同源或異源二聚體化，導(dǎo)致其胞內(nèi)段受體酪氨酸激酶發(fā)生自身磷酸化，主要通過ERK、Akt和JNK通路傳導(dǎo)活化信號。當其異�；罨蚪到庖种茣r，可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生。有研究證明，許多人類腫瘤中均過表達EGFR，且EGFR的表達水平與治療反應(yīng)不佳、疾病惡化及存活率低相關(guān)。 細絲蛋白A（Filamin A，F(xiàn)LNa）是第一個在非肌細胞中被發(fā)現(xiàn)的肌動蛋白結(jié)合蛋白。其可形成同源二聚體，與肌動蛋白交聯(lián)構(gòu)成動態(tài)三維立體結(jié)構(gòu)。FLNa作為腳手架可錨定90余種伴侶分子，其中包括多種細胞膜受體，調(diào)控諸如細胞形狀、細胞移動、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等多種細胞功能和生理過程。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生不僅與EGFR持續(xù)活化、蛋白降解抑制有關(guān)，并且與FLNa構(gòu)成的復(fù)雜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，可由于FLNa異常表達影響其與伴侶錨定聯(lián)接，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。盡管已證實FLNa與導(dǎo)致惡性腫瘤的信號異常有關(guān)，但其具體機制仍有待研究。 我們利用不表達FLNa的人惡性黑色素瘤M2細胞株和經(jīng)FLNa基因轉(zhuǎn)染M2細胞獲得的穩(wěn)定表達FLNa的M2A7細胞進行的實驗結(jié)果顯示，雖然M2細胞EGFR蛋白表達量明顯高于M2A7細胞，但經(jīng)EGF刺激后EGFR磷酸化的量卻明顯少于M2A7細胞。此結(jié)果提示，EGFR表達量的多少并不代表其活化程度，可能還有其它因素調(diào)控著EGFR的活化，臨床上不能僅僅根據(jù)EGFR的表達量來評價腫瘤患者的預(yù)后，研究調(diào)控EGFR活化的新機制具有重要的理論和實用價值。 為此，本實驗擬通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，改變?nèi)藧盒院谏亓黾毎鸉LNa的表達水平，觀察FLNa表達變化對惡性黑色素瘤細胞增殖、遷移、侵襲的影響；接種裸鼠，觀察FLNa表達變化對惡性黑色素瘤細胞成瘤能力的影響；通過蛋白印跡（western blot）及免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）檢測FLNa表達變化對EGFR及其下游信號磷酸化水平的影響；收集臨床資料，觀察人惡性黑色素瘤組織中FLNa表達與預(yù)后之間的關(guān)系。以期揭示FLNa與惡性黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展的分子機制，為FLNa成為惡性黑色素瘤臨床診斷參考指標和基因治療新靶點等提供理論依據(jù)。 方法： 1FLNa對人惡性黑色素瘤細胞株增殖、遷移及侵襲的影響 體外培養(yǎng)不表達FLNa的人惡性黑色素瘤M2細胞及其穩(wěn)定表達FLNa的亞克隆M2A7細胞；將表達FLNa-shRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染高表達FLNa的人惡性黑色素瘤UACC647細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細胞，利用western blot驗證沉默效果。 1.1體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細胞增殖能力的影響 利用MTT法體外檢測FLNa對細胞活力的影響。實驗細胞分別接種于96孔板，血清饑餓4小時后，加入不同濃度EGF（4,20,100nM）培養(yǎng)44小時，加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去上清液，加入DMSO振蕩溶解后置于酶標儀570nm處檢測OD值。 利用平板克隆法體外檢測FLNa對細胞貼壁后克隆形成的影響。實驗細胞吹打混勻為單細胞懸液后分別接種于35mm培養(yǎng)皿，在含1%或10%胎牛血清培養(yǎng)基及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周，蘇木素染色后，鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)量。 利用軟瓊脂克隆法體外檢測FLNa對細胞非錨定增殖的影響。用含0.35%低熔點瓊脂糖的培養(yǎng)基制備單細胞懸液后，分別接種于預(yù)先鋪有含0.6%瓊脂糖培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板，在含1%或10%胎牛血清及EGF刺激條件下培養(yǎng)2周，鏡下觀察并計數(shù)克隆形成數(shù)量。 1.2利用劃痕法體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細胞遷移的影響 實驗細胞分別接種于96孔培養(yǎng)板并饑餓培養(yǎng)4小時。使用無菌移液器吸頭在單層細胞上均勻劃痕，漂洗脫落細胞。無或加入EGF（20nM）繼續(xù)培養(yǎng)，定時觀察并拍照記錄至劃痕愈合，以劃痕初始寬度為1計算各時間點相對寬度值。 1.3利用Transwell小室法體外檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細胞侵襲的影響 預(yù)饑餓的實驗細胞分別置于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清MEM或1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，上室未穿膜細胞用棉簽擦去，已穿膜細胞用甲醇固定、HE染色，光鏡觀察并拍照計數(shù)。 2FLNa對人惡性黑色素瘤細胞EGFR信號通路分子的影響 預(yù)饑餓細胞分別接受EGF（20nM）刺激0、5、10、30分鐘，加入蛋白裂解液提取總蛋白。將等濃度等體積蛋白樣本經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。利用3%牛血清白蛋白或5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，分別加入抗磷酸化酪氨酸、EGFR、磷酸化ERK、總ERK和-actin等一抗，4C過夜，次日加入相應(yīng)二抗，曝光顯影，使用ImageJ軟件定量分析蛋白條帶灰度值。 裂解實驗細胞，向蛋白裂解液分別加入小鼠抗EGFR抗體和小鼠IgG于4C過夜?jié)L動混勻。次日加入蛋白G瓊脂糖微珠滾動混勻。漂洗微珠后，經(jīng)加熱獲取洗脫液，用抗磷酸化酪氨酸抗體進行western blot檢測。 3FLNa對人惡性黑色素瘤細胞裸鼠體內(nèi)成瘤的影響 將UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細胞分別接種于5周齡雌性BALB/c裸鼠右后肢。成瘤后每周2次測量瘤體直徑并稱重。4周后處死裸鼠，剝?nèi)×鼋M織并稱重拍照。提取瘤組織總蛋白，利用western blot檢測不同瘤組織EGFR磷酸化水平。石蠟包埋瘤組織，免疫組織化學(xué)法檢測FLNa及Ki-67表達。兩位病理學(xué)家獨立判斷FLNa和Ki-67的表達情況。采用H指數(shù)法半定量分析FLNa表達；統(tǒng)計500個腫瘤細胞內(nèi)Ki-67表達情況，計算其陽性表達率。 4FLNa和Ki-67在人惡性黑色素瘤組織中的表達 從白求恩國際和平醫(yī)院病理科選取30例惡性黑色素瘤組織標本，采用免疫組化計數(shù)分別檢測FLNa和Ki-67的表達情況，并分析FLNa的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系。 結(jié)果： 1FLNa促進人惡性黑色素瘤細胞體外增殖、遷移和侵襲 通過穩(wěn)定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)得到沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細胞株。蛋白印跡法檢測，與親本細胞組及陰性對照組相比，UACC647(KD)細胞FLNa的表達被抑制70%以上。 通過MTT實驗檢測，在不同濃度EGF（4nM，20nM，100nM）刺激下，與不表達FLNa的M2細胞相比，表達FLNa的M2A7細胞均展示出更高的增殖能力；但是在無EGF刺激情況下，，兩者增殖能力基本相同。類似的是，隨著將UACC647細胞FLNa沉默表達，在有或無EGF刺激下，其增殖能力均有所降低。平板克隆形成及軟瓊脂克隆形成實驗均顯示，在EGF刺激下，F(xiàn)LNa表達水平較高的M2A7和UACC647(ctrl)細胞形成克隆的能力均強于FLNa表達水平較低的M2和UACC647(KD)細胞。 通過劃痕實驗檢測，在有或無EGF刺激下，高表達FLNa的M2A7和UACC647(ctrl)細胞遷移能力均強于相應(yīng)低表達FLNa的M2和UACC647(KD)細胞；其中在EGF刺激下，劃痕后12小時M2A7細胞的劃痕相對寬度值為0，而M2細胞劃痕相對寬度值為0.58±0.03；劃痕后15小時UACC647(ctrl)細胞的劃痕相對寬度值為0，而UACC647(KD)細胞劃痕相對寬度值為0.51±0.01。 通過Transwell小室實驗檢測，與M2細胞相比，表達FLNa的M2A7細胞穿透Matrigel基質(zhì)膠的侵襲能力約是其1.9倍(P 0.01)。與此一致的是，沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細胞的侵襲能力較UACC647(ctrl)細胞降低了1.8倍(P 0.01)。 2FLNa對人惡性黑色素瘤細胞配體誘導(dǎo)的EGFR信號通路的影響 通過Western blot檢測，雖然不表達FLNa的M2細胞表達更多的EGFR，但EGF刺激后磷酸化EGFR水平卻明顯低于表達FLNa的M2A7細胞。后續(xù)進行的免疫沉淀實驗也得到了類似的結(jié)果。檢測EGFR下游信號通路中ERK磷酸化情況，發(fā)現(xiàn)在EGF刺激下，M2A7細胞中磷酸化ERK水平明顯高于M2細胞。在UACC647(ctrl)細胞和沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細胞上進行的實驗也得到一致的結(jié)果，隨著FLNa表達水平降低，EGF引起的EGFR和ERK磷酸化水平明顯下降，與UACC647(ctrl)細胞相比，EGF刺激10分鐘后，UACC647(KD)細胞磷酸化EGFR比率降低了70%。免疫沉淀實驗也證實了UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細胞中EGFR磷酸化水平的區(qū)別。與UACC647(ctrl)細胞相比，沉默F(xiàn)LNa導(dǎo)致EGF引起的UACC647(KD)細胞磷酸化ERK比率顯著降低1.4倍。由此推斷， FLNa可增強EGF刺激引起的EGFR酪氨酸磷酸化水平，并活化其下游Ras-Raf-MEK-ERK通路。 3FLNa促進人惡性黑色素瘤細胞裸鼠種植瘤生長 通過在裸鼠皮下接種UACC647(ctrl)和UACC647(KD)細胞檢測FLNa對人惡性黑色素瘤細胞體內(nèi)增殖的影響。與UACC647(ctrl)相比，沉默F(xiàn)LNa表達的UACC647(KD)細胞在裸鼠體內(nèi)的生長明顯減慢。免疫組織化學(xué)法檢測顯示，在UACC647(ctrl)細胞形成的腫瘤組織中可見彌漫、深染的Ki-67沉著于胞核，而強陽性表達的FLNa信號分布于胞漿。與此相反的是， UACC647(KD)細胞形成的瘤組織中僅有弱陽性Ki-67和FLNa表達。經(jīng)線性統(tǒng)計分析，F(xiàn)LNa的H指數(shù)為64.33±10.59，且與Ki-67表達呈正相關(guān)（r=0.88; P 0.01）。western blot檢測顯示，UACC647(KD)細胞所形成的腫瘤組織中磷酸化EGFR和ERK所占比率分別下降80%和46%。上述結(jié)果支持沉默F(xiàn)LNa抑制惡性黑色素瘤細胞體外、體內(nèi)增殖的觀點。 4FLNa低表達預(yù)示惡性黑色素瘤患者較好預(yù)后 經(jīng)兩位病理學(xué)家獨立分析判斷，30例惡性黑色素瘤標本中FLNa表達的H指數(shù)為69.77±5.17。經(jīng)統(tǒng)計分析，F(xiàn)LNa表達與Ki-67表達正相關(guān)（r=0.60; P 0.01），而與總生存期呈負相關(guān)（r=-0.45; P=0.013）。選取H指數(shù)中位數(shù)分組，高表達FLNa組患者的總生存期明顯縮短（中位生存期為594天），顯著低于而低表達FLNa組患者（中位生存期為1949天；P=0.0011）。然而，本實驗未發(fā)現(xiàn)FLNa表達與患者年齡、性別和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)之間的相關(guān)性。 結(jié)論： 1增加或沉默F(xiàn)LNa的表達可增強或抑制人惡性黑色素瘤細胞體外增殖、遷移和侵襲能力。 2沉默F(xiàn)LNa表達可抑制人惡性黑色素瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤生長。 3FLNa可通過增強EGF誘導(dǎo)的EGFR活化（磷酸化）及其下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)促進惡性黑色素瘤細胞的生長。 4惡性黑色素瘤患者腫瘤組織中FLNa表達水平與Ki-67呈正相關(guān)，與總生存期呈負相關(guān)；FLNa低表達預(yù)示惡性黑色素瘤患者預(yù)后較好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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1 Andrea J. McKinney;Sheri L. Holmen;;Animal models of melanoma: a somatic cell gene delivery mouse model allows rapid evaluation of genes implicated in human melanoma[J];癌癥;2011年03期

2 王慧娟;袁靜;馬智勇;;非小細胞肺癌治療的新靶點:EML4-ALK融合基因[J];中國肺癌雜志;2011年06期

3 袁玲;;原發(fā)性肝癌分子靶向治療的進展[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版);2008年06期

4 李寧;段向紅;陳小兵;王新鋒;羅素霞;;靶向治療——漸行漸近[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(B);2012年06期

5 Van Cutsem E;Feyereislova A;張信華;;曲妥珠單抗聯(lián)合化療與單純化療治療HER2陽性晚期胃或胃食管結(jié)合部癌的Ⅲ期、開放、隨機對照臨床試驗(ToGA試驗)[J];消化腫瘤雜志(電子版);2010年03期

本文編號：1491486