本文關(guān)鍵詞：小鼠骨髓源性DC的提取及其與惡性黑色素瘤細(xì)胞融合細(xì)胞制備的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《大連醫(yī)科大學(xué)》 2012年

小鼠骨髓源性DC的提取及其與惡性黑色素瘤細(xì)胞融合細(xì)胞制備的研究

史鵬  

【摘要】：目的：探討GM-CSF和IL-4劑量的變化對原代小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞提取數(shù)量、純度的影響以及應(yīng)用PEG法制備樹突狀細(xì)胞和惡性黑色素瘤細(xì)胞融合細(xì)胞時(shí)的適宜分子。 方法：取4周SPF級雄性C57BL/6小鼠，斷頸處死，分離出小鼠股骨和脛骨，取骨髓細(xì)胞，應(yīng)用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6孔板中，每孔加1.5ML完全培養(yǎng)基，然后置入含5%CO2濃度37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。貼壁3小時(shí)后，棄上清，用含有不同劑量GM-CSF（200,500,1000）和IL-4（200,500,1000）的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，第5天加入TNF-α1.5ML刺激細(xì)胞成熟。分別對不同分組的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)分析樹突狀細(xì)胞不同成熟度下細(xì)胞因子（MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD83）表達(dá)的變化、測定細(xì)胞純度，，免疫熒光技術(shù)測定成熟細(xì)胞因子CD83表達(dá)。將培養(yǎng)至第七天的成熟樹突狀細(xì)胞和對數(shù)生長期的惡性黑色素瘤細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)基重懸。應(yīng)用PKH67-GL和PKH26-GL分別染色樹突狀細(xì)胞和惡性黑色素瘤細(xì)胞。分別應(yīng)用PEG-3000和PEG-4000制備融合細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的融合過程，并進(jìn)行融合細(xì)胞純度和數(shù)量的估算。 結(jié)果：加入GM-CSF濃度為1000U/ml，IL-4濃度為500U/ml組的樹突狀細(xì)胞，細(xì)胞密度適中，偽足狀的樹突結(jié)構(gòu)明顯，呈現(xiàn)典型的樹突狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)，明顯的優(yōu)于其他3組（P0.05）。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表型的變化證明了樹突狀細(xì)胞成熟度改變而致細(xì)胞表型變化的特性。免疫熒光檢測成熟樹突狀細(xì)胞，可見細(xì)胞高表達(dá)CD83。應(yīng)用PEG-3000制備的融合細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見大量PKH67-GL（綠色）與PKH26-GL（紅色）染色后的細(xì)胞，同時(shí)可見激發(fā)出黃光，細(xì)胞體積較上述兩種細(xì)胞大的融合細(xì)胞，融合率約40%-50%，細(xì)胞密度和融合率明顯高于PEG-4000制備的細(xì)胞。 結(jié)論：1、不同濃度濃度的刺激因子影響原代的提取數(shù)量和純度，提取原代細(xì)胞刺激因子適宜的濃度分別為GM-CSF：1000U/ML；IL-4：500U/ML。2、PEG-3000在分子量上最適宜制備樹突狀細(xì)胞和惡性黑色素瘤細(xì)胞融合細(xì)胞。

【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.5
【目錄】：

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本文編號：148819