本文關(guān)鍵詞：TNF-α誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞衰老作用機(jī)制研究　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的 腫瘤壞死因子-a (Tumor Necrosis Factor, TNF-a)是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子,是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一。在前期的研究中發(fā)現(xiàn),TNF-a能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞發(fā)生自體吞噬,但是其是否能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16和B16F10細(xì)胞發(fā)生衰老目前尚不清楚。因此,本研究旨在探討TNF-a是否能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生衰老及其誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的作用機(jī)制。 方法 1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16和B16F10細(xì)胞,根據(jù)處理方法的不同分為3組：對(duì)照組、TNF-a處理組(20ng/ml TNF-a處理12h、24h、48h)、3-MA+TNF-a處理組(10mmol/L3-MA預(yù)處理2h,20ng/ml TNF-a處理12h、24h、48h)。 2.相差顯微鏡觀察油紅O染色后TNF-a處理不同時(shí)間點(diǎn)B16細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量的變化。 3.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)TNF-a處理不同時(shí)間點(diǎn)B16和B16F10細(xì)胞周期G1/Go期百分比的變化。 4.收取不同處理組的B16和B16F10細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)衰老相關(guān)基因p16、p21、p53、CDK2、CDK4、CyclinD. CyclinE、 Rb、E2F-1mRNA的表達(dá)變化。 5.收取不同處理組的B16細(xì)胞,RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測(cè)細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p53、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因Rb磷酸化水平的變化、細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子E2F-1和Ras-Raf-MAPK信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白K-Ras、磷酸化Erk、NF-κB的表達(dá)變化。以及自噬標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、自噬性死亡標(biāo)志蛋白Beclin1在B16F10細(xì)胞中的表達(dá)變化。 結(jié)果 1.與對(duì)照組相比,TNF-a處理24h后B16細(xì)胞內(nèi)有少量脂滴出現(xiàn),TNF-a處理48h后B16細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的脂滴,具有明顯的時(shí)效關(guān)系； 2.與對(duì)照組相比,TNF-a處理48h后B16細(xì)胞G1/G0期所占百分比顯著升高,3MA+TNF-a處理組的B16細(xì)胞G1/G0期的百分比高于TNF-a處理組；與對(duì)照組相比,TNF-a處理后B16F10細(xì)胞G1/G0期所占百分比顯著升高,且具有明顯的時(shí)效關(guān)系； 3.在正常小鼠黑色素細(xì)胞mela細(xì)胞中,能夠檢測(cè)到p16基因,而黑色素瘤細(xì)胞B16和B16F10細(xì)胞中未檢測(cè)到p16基因； 4.與對(duì)照組相比,TNF-a處理12h后B16細(xì)胞內(nèi)衰老標(biāo)志性基因p21mRNA的表達(dá)變化不明顯,p53mRNA的表達(dá)顯著升高；3MA+TNF-a處理12h后B16細(xì)胞中p21、p53mRNA的表達(dá)水平較TNF-a處理組升高； 5.與對(duì)照組相比,TNF-a處理組B16細(xì)胞中p21、p53的下游關(guān)鍵基因CyclinE、 E2F-1mRNA的表達(dá)水平顯著降低,Rb mRNA的表達(dá)水平顯著升高； 6.與對(duì)照組相比,經(jīng)TNF-a處理后的B16F10細(xì)胞中p21mRNA的表達(dá)變化不明顯,p53mRNA的表達(dá)水平顯著升高,到48h B16F10細(xì)胞內(nèi)p53mRNA的表達(dá)下降至初始水平； 7.與對(duì)照組相比,TNF-a處理的B16F10細(xì)胞中p21、p53的下游關(guān)鍵基因CDK2、CDK4、CyclinE、E2F-1mRNA的表達(dá)水平顯著下降；CyclinD mRNA的表達(dá)水平在24h時(shí)顯著升高,到48h時(shí)下降；Rb mRNA的表達(dá)變化不明顯； 8.與對(duì)照組相比,TNF-a處理組B16F10細(xì)胞內(nèi)LC3、Beclinl的表達(dá)升高且高于3-MA+TNF-a處理組； 9.與對(duì)照組相比,3-MA+TNF-a處理組B16細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平顯著升高,且高于TNF-a處理組； 10.與對(duì)照組相比,TNF-a處理組與3-MA+TNF-a處理組B16細(xì)胞RB蛋白的磷酸化水平顯著下降； 11.與對(duì)照組相比,TNF-a處理12h后B16細(xì)胞內(nèi)E2F-1蛋白的表達(dá)下降,24h時(shí)E2F-1蛋白的表達(dá)上升至初始水平； 12.與對(duì)照組相比,TNF-a處理后B16細(xì)胞內(nèi)Ras-Raf-MAPK信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白K-Ras和pErk的表達(dá)顯著升高,3-MA+TNF-a處理組B16細(xì)胞中K-Ras蛋白和Erk蛋白的磷酸化水平高于TNF-a處理組； 13.與對(duì)照組相比,TNF-a處理后B16細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平顯著升高,3-MA+TNF-a處理組B16細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)水平高于TNF-a處理組。 結(jié)論 1. TNF-a除了能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞發(fā)生自體吞噬,還能夠誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16和B16F10細(xì)胞發(fā)生衰老。 2. TNF-a可能通過自體吞噬誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生衰老,且適度的自噬能夠延緩小鼠黑色素瘤細(xì)胞衰老。 3. TNF-a通過Ras-Raf-MAPK和P53-P21-Rb信號(hào)通路誘導(dǎo)B16細(xì)胞發(fā)生衰老。 4. NF-κB可能在B16細(xì)胞衰老過程具有重要的調(diào)控作用。 5.小鼠黑色素瘤細(xì)胞存在著p16基因的缺失。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1311324