發(fā)布時間：2017-12-12 18:23

  本文關鍵詞：梅毒螺旋體膜蛋白Tp0965體外活化血管內(nèi)皮細胞及對細胞通透性影響機制研究

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【摘要】：背景 梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum subsp.pallidum, Tp)感染所致慢性系統(tǒng)性炎癥性疾病,血管內(nèi)皮細胞的活化和損傷在梅毒發(fā)病中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)Tp可以直接活化血管內(nèi)皮細胞,亦可通過其膜蛋白作用于血管內(nèi)皮細胞,導致血管內(nèi)皮細胞的活化和損傷。由于Tp在體外培養(yǎng)基上無法培養(yǎng),對Tp膜蛋白的研究成為研究梅毒發(fā)病機制及免疫反應機制的重點之一�；蚬こ碳夹g的發(fā)展為Tp膜蛋白的研究提供技術保障。Tp0965是一種膜融合蛋白,位于Tp的細胞周質(zhì),我們前期研究結果顯示,Tp0965可與臨床各病期的梅毒患者陽性血清發(fā)生抗原抗體反應。本研究利用基因重組技術獲得高純度的Tp0965,隨后將重組蛋白Tp0965(recombinant Tp0965, rTp0965)與人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)混合培養(yǎng),觀察rTp0965對HUVEC活化及HUVEC單層通透性的影響,探討Tp0965在Tp所致血管內(nèi)皮細胞的活化和損傷中的作用,為梅毒發(fā)病機制研究提供實驗基礎。 目的 研究梅毒螺旋體膜蛋白Tp0965體外對血管內(nèi)皮細胞活化及血管內(nèi)皮屏障通透性的影響,探討膜蛋白Tp0965在血管內(nèi)皮細胞活化及損傷中的作用,為梅毒發(fā)病機制研究提供依據(jù)。 方法 1.rTp0965的表達和純化 將已構建成功的重組質(zhì)粒pET-28a(+)/Tp0965轉(zhuǎn)化表達宿主菌株E.coli Rosetta(DE3),超聲震碎細菌,取上清液進行SDS-PAGE分析,蛋白印跡法鑒定。將鑒定成功重組質(zhì)粒pET-28a(+)/Tp0965表達于DE3,大規(guī)模誘導表達,利用蛋白純化試劑盒對獲得蛋白進行純化,BCA法檢測重組蛋白的濃度,然后采用多粘菌素B柱去除大腸桿菌內(nèi)毒素,獲得具有生物學活性的rTp0965o 2.HUVEC體外活化 將HUVEC接種于細胞培養(yǎng)板,加入rTp0965,使終濃度為5Ong/mL.100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL、800ng/mL,分別培養(yǎng)3h、6h、12h、24h、48h。取培養(yǎng)上清液,ELISA檢測細胞因子MCP-1的分泌水平。Cell ELISA法檢測粘附分子ICAM-1及E-selectin在HUVEC膜上的表達水平；熒光定量Real-time PCR檢測細胞中MCP-1、ICAM-1及E-selectin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。 3.THP-1細胞向HUVEC的遷移和粘附 將HUVEC接種于細胞培養(yǎng)板上,加入rTp0965混合培養(yǎng)24h,加入calcein-AM (5μmol/L)標記的THP-1細胞,繼續(xù)培養(yǎng)6h,PBS洗去未粘附的THP-1細胞,熒光顯微鏡下計數(shù)未粘附的THP-1細胞,按公式THP-1細胞的黏附率=(加入總THP-1細胞數(shù)-未粘附THP-1細胞數(shù)/加入總THP-1細胞數(shù)×100%),計算THP-1細胞的黏附率。 將HUVEC接種于Transwell小室的下室,加入rTp0965,混合培養(yǎng)24h,在Transwell小室的上室加入calcein AM (5μm)標記的THP-1細胞,繼續(xù)培養(yǎng)1h,取下室培養(yǎng)基20μL,熒光倒置顯微鏡下計數(shù)THP-1細胞,按公式THP-1細胞的遷移率=穿過的THP-1細胞數(shù)/加入總THP-1細胞數(shù)×100%,計算THP-1細胞的遷移率。4.構建HUVEC單層模型 HUVEC接種于將已包被基質(zhì)膠的Transwell小室,置于37℃、5%CO2孵育箱培養(yǎng),觀察HUVEC鋪滿整個小室底部,然后進行4h液面滲漏試驗檢測,選擇4h液面滲漏試驗陽性的模型,作為實驗模型。 5.HUVEC單層通透性改變 將rTp0965加入HUVEC單層模型的Transwell小室內(nèi),混合培養(yǎng)后,加入HRP溶液,繼續(xù)培養(yǎng),于培養(yǎng)1h和4h時取下室培養(yǎng)基50gL于96孔板中置于4℃避光保存,取樣全部完畢,向96孔板樣本中加入四甲基聯(lián)苯胺,顯色后加入硫酸終止顯色反應,酶標儀測量450nm波長處樣本A值。 6.HUVEC緊密連接蛋白表達及細胞骨架系統(tǒng)重排 將HUVEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板上,加入rTp0965,繼續(xù)培養(yǎng)24h,胰蛋白酶消化細胞,裂解細胞,提取總蛋白,蛋白印跡法檢測緊密連接蛋白Claudin-1蛋白表達水平。同時將HUVEC接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿上,加入rTp0965,繼續(xù)培養(yǎng),多聚甲醛固定,加入FITC-Phalloidin工作液染色細胞,激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架蛋白F-actin的變化。 7.RhoA/ROCK信號通路的調(diào)控作用 將HUVEC接種于細胞培養(yǎng)板上,加入RhoA/ROCK信號通路抑制劑Y-27632,培養(yǎng)30min,加入rTp0965,繼續(xù)培養(yǎng)24h,提取細胞總蛋白,蛋白印跡法檢測緊密連接蛋白Claudin-1蛋白表達水平。同時將HUVEC接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿上,加入Y-27632,培養(yǎng)30min,加入rTp0965,繼續(xù)培養(yǎng),多聚甲醛固定,加入FITC-Phalloidin工作液染色細胞,激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞骨架蛋白F-actin的變化。 將Y-27632加入HUVEC單層模型的Transwell、室內(nèi),培養(yǎng)3Omin,加入rTp0965,繼續(xù)培養(yǎng)24h,向Transwell小室內(nèi)加入calcein AM標記的THP-1細胞,下室內(nèi)加入MCP-1,繼續(xù)培養(yǎng),分別于培養(yǎng)1h及4h時取下室培養(yǎng)基20μL,熒光倒置顯微鏡下計數(shù)THP-1細胞,按公式THP-1細胞的遷移率=穿過的THP-1細胞數(shù)/加入總THP-1細胞數(shù)×100%,計算THP-1細胞的遷移率。 結果 1.重組蛋白Tp0965的表達和純化 SDS-PAGE分析顯示清晰的相對分子量約40kDA的條帶,蛋白印跡法結果顯示可與二期梅毒陽性血清發(fā)生抗原抗體反應。BCA法檢測重組蛋白的濃度為1.1mg/mL,多粘菌素B柱去除大腸桿菌內(nèi)毒素鱟試劑檢測顯示內(nèi)毒素含量為2.0EU/mL。 2.rTp0965體外對HUVEC活化的影響 rTp0965刺激IUVEC后,培養(yǎng)上清中MCP-1分泌水平顯著高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=14.5P0.05)；rTp0965刺激組的ICAM-1及E-selectin的HUVEC膜表達水平亦顯著高于陰性對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t1=6.6,t2=7.0,均P0.05); Real-time PCR檢測結果顯示,rTp0965刺激組HUVEC中MCP-1、ICAM-1及E-selectin的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于陰性對照組(t1=14.0,t2=5.6,t3=8.7,均P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。 3.rTp0965對HUVEC與THP-1細胞趨化和粘附的影響 實驗結果顯示,rTp0965刺激HUVEC后,HUVEC與THP-1細胞的粘附率為48.5±7.5%,顯著高于陰性對照組(233±7.9%),經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=13.8,P0.05)。rTp0965刺激后,THP-1細胞的遷移率顯著增加,為56.9±3.1%,顯著高于陰性對照組(13.8±1.8%),經(jīng)χ2檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=40.6,P0.05)。 4.rTp0965對HUVEC單層通透性的影響 ELISA檢測結果顯示rTp0965刺激組HUVEC單層HRP流量在1h時即顯著高于陰性對照組(0.42±0.08與0.15±0.07,t=4.40P0.05)；4h時HRP流量差距明顯加大(1.2±0.11與0.52±0.06,t=9.40,P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。 5.rTp0965對HUVEC緊密連接蛋白表達及細胞骨架系統(tǒng)的影響 蛋白印跡法結果顯示,rTp0965刺激組HUVEC內(nèi)的緊密連接蛋白Claudin-1的表達水平顯著低于陰性對照組。激光共聚焦顯微鏡下顯示,陰性對照組HUVEC內(nèi)的F-actin主要富集于細胞膜的周邊,分布均勻,rTp0965組細胞周邊的F-actin明顯減少,胞漿中出現(xiàn)密集的應力纖維。6.rTp0965對THP-1細胞跨HUVEC遷移的影響實驗結果顯示,rTp0965刺激組THP-1細胞穿過HUVEC細胞單層的遷移率顯著高于陰性對照組(34.8±1.2%與12.7±0.9%,χ2=13.5,P0.05),差異有統(tǒng)計學意義。 7.RhoA/ROCK信號通路的調(diào)控作用 用RhoA/ROCK信號通路特異性抑制劑Y27632預處理30min后,再加入rTp0965刺激HUVEC,HUVEC的緊密連接蛋白Claudin-1的表達水平較單用rTp0965刺激組高,THP-1細胞穿過HUVEC細胞單層的遷移率較單用rTp0965刺激組低(19.0±1.0%與34.8±1.2%,χ2=6.3P0.05),細胞骨架蛋白F-actin的重排程度較單用rTp0965刺激組低。說明RhoA/ROCK信號通路參與調(diào)節(jié)rTp0965介導的HUVEC單層通透性的增加。 結論 1.利用原核生物表達外源基因tp0965可獲得高純度rTp0965,此蛋白可適用于梅毒發(fā)病機制的相關研究。 2.rTp0965可促進HUVEC分泌MCP-1,上調(diào)ICAM-1及E-selectin的膜表達水平及mRNA轉(zhuǎn)錄水平,促進THP-1細胞向HUVEC的趨化運動,提高HUVEC對THP-1細胞的粘附能力,rTp0965可體外活化血管內(nèi)皮細胞。 3.rTp0965可能通過改變細胞骨架蛋白重排及緊密連接蛋白表達提高血管內(nèi)皮細胞的通透性,hoA/ROCK信號轉(zhuǎn)導通路參與調(diào)節(jié)rTp0965介導的血管內(nèi)皮通透性改變。 4.梅毒螺旋體膜蛋白Tp0965在血管內(nèi)皮細胞的活化及損傷中起一定作用,為梅毒發(fā)病機制研究提供依據(jù)。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R759.1

【參考文獻】

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本文編號：1283502