本文關(guān)鍵詞：鋅指蛋白PRDM5在黑色素瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機制

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【摘要】：背景惡性黑色素瘤多發(fā)于皮膚,轉(zhuǎn)移性很高,是人類皮膚癌中致死率最高的腫瘤,嚴重威脅人類健康,因此進一步研究黑色素瘤轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找新的分子治療靶點,對于提高黑色素瘤的治療效率有重要意義。PR區(qū)域蛋白家族(PRDI-BF1 and RIZ domain containing,PRDM)屬于鋅指蛋白家族,是一類組織特異性的轉(zhuǎn)錄因子,在細胞分化和惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用,其家族大多數(shù)成員為原癌基因或抑癌基因,與癌癥發(fā)生有密切關(guān)系。PRDM5(又名PFM2)是該家族中新發(fā)現(xiàn)的一員,在多種腫瘤組織中呈低表達,與腫瘤細胞凋亡有密切關(guān)系,但是其在黑色素瘤中的功能尚缺乏研究。目的1.分析PRDM5對黑色素瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響;2.研究PRDM5促進黑色素瘤轉(zhuǎn)移中的分子機制。方法1.PRDM5對黑色素瘤細胞B16F10增殖能力的影響將構(gòu)建的PRDM5過表達和基因沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至黑色素瘤細胞B16F10細胞,48h后將細胞接種至96孔板,MTT檢測PRDM5過表達和基因沉默對細胞增殖的影響。將PRDM5基因沉默質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至黑色素瘤細胞,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞,大量培養(yǎng)并凍存?zhèn)溆�。小鼠皮下注射PRDM5基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,解剖小鼠并稱量腫瘤節(jié)重量,統(tǒng)計分析PRDM5基因沉默對黑色素瘤細胞體內(nèi)增殖的影響。2.PRDM5對黑色素瘤細胞B16F10遷移和侵襲能力的影響將prdm5過表達和基因沉默質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞,48h后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜,劃出痕跡并分別在不同時間測量劃痕的寬度,以計算出細胞的遷移能力。使用corning公司的transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力的變化,以nih-3t3細胞的條件培養(yǎng)液作為趨化因子。培養(yǎng)24h后,去除上層的細胞,遷移穿過的細胞通過0.5%結(jié)晶紫染色后計數(shù)。小鼠尾靜脈注射prdm5基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,解剖小鼠,觀察其主要內(nèi)臟器官腫瘤轉(zhuǎn)移情況,計算肺部腫瘤數(shù),研究prdm5基因沉默對細胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。3.prdm5促進黑色素瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的分子機制裂解prdm5基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,提取蛋白質(zhì),同時將prdm5過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至黑色素瘤細胞,裂解細胞提蛋白,免疫印跡檢測細胞裂解液中jnk、erk和wnt信號通路中相關(guān)蛋白表達及活性水平,通過加入相應(yīng)抑制劑和sirna等方法,了解細胞轉(zhuǎn)移過程中有關(guān)的分子機制。結(jié)果1.prdm5促進黑色素瘤細胞b16f10的增殖通過mtt法間接檢測活細胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)prdm5過表達細胞的數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細胞。小鼠背部皮下注射prdm5基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞,2周后比較腫瘤大小并稱量,發(fā)現(xiàn)來自prdm5基因沉默(siprdm5)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的腫瘤,不論是大小還是重量都明顯低于sictl穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞引起的腫瘤,說明prdm5對b16f10細胞增殖有促進作用;2.prdm5促進黑色素瘤細胞b16f10的遷移和侵襲細胞劃痕愈合實驗發(fā)現(xiàn),prdm5過表達細胞劃痕最早愈合。細胞遷移和侵襲實驗計算穿過小室細胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)prdm5基因沉默穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞遷移和侵襲能力最弱。這些結(jié)果表明prdm5促進黑色素瘤細胞遷移和侵襲;3.prdm5通過mapk/jnk和erk信號通路促進b16f10細胞增殖和轉(zhuǎn)移免疫印跡結(jié)果顯示,PRDM5過表達時,細胞中JNK蛋白表達及磷酸化水平都明顯上調(diào),ERK磷酸化水平上調(diào),加入抑制劑后磷酸化下調(diào)并且細胞增殖和侵襲能力也受到抑制,以上結(jié)果都說明了,PRDM5主要通過激活JNK和ERK信號通路進而促進B16F10細胞發(fā)生和轉(zhuǎn)移。結(jié)論本實驗結(jié)果顯示,PRDM5對小鼠黑色素瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有促進作用,并且主要通過MAPK/JNK和ERK信號通路調(diào)節(jié)小鼠黑色素瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,這將為PRDM5在癌癥發(fā)生中的作用提供分子機制研究基礎(chǔ),最重要的是為臨床治療黑色素瘤提供新的思路。
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5

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4 實習生 易立;黑色素瘤,是否無藥可治？[N];科技日報;2011年

5 記者 張e，

本文編號：1231620