發(fā)布時間：2017-11-19 11:16

  本文關鍵詞：BMP2在雌激素變化參與的皮膚衰老過程中的作用機制研究

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【摘要】：第一部分BMP-2在雌激素抗去勢大鼠皮膚衰老中的作用研究 目的 探討雌激素水平對皮膚組織的影響,為臨床上絕經(jīng)后婦女皮膚衰老的發(fā)病機制及皮膚組織病理學變化提供實驗依據(jù)。 方法 30只雌性成年Wistar大鼠,隨機分為去勢組(ovariectomized group,Mod, n=10)、假手術組(sham-operated group,Sham,n=10)、去勢+雌激素組(ovariectomized and estrogen injection group,OEI,n=10);去勢組切除雙側(cè)卵巢,大鼠術前禁水,取6%水合氯醛(0.5mL/100mg)腹腔注射,麻醉后固定四肢,在脊柱兩側(cè)第12肋尾側(cè)剪毛,用2%碘酊皮膚消毒,75%酒精脫碘。沿脊柱后正中線外側(cè)1～1.5cm處,以縱形切口依次切開皮膚、分離肌肉、打開壁層腹膜,進入腹膜腔,找到卵巢并切除。假手術組步驟同去勢組,但不切除卵巢,只切除卵巢周圍小部分脂肪組織。去勢+雌激素組：切除大鼠雙側(cè)卵巢后,于術后第2天開始皮下注射雌二醇0.05mg/d,持續(xù)6天。大鼠飼養(yǎng)6周后腹腔注射水合氯醛后背部凈毛,在背部脊柱兩側(cè)分別取全層皮膚,主要為真皮成分,共切割2個圓形創(chuàng)面,直徑1.8cm,深至皮下,內(nèi)、外兩側(cè)分別做HE染色標本和免疫組化標本。采用放射免疫方法檢測了血清雌二醇水平,免疫組化方法檢測了皮膚組織BMP-2蛋白的表達；應用光學顯微鏡對皮膚組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進行了觀察,苦味酸-天狼猩紅染色偏振光分析皮膚膠原沉積,分析大鼠皮膚中Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例,所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。 結(jié)果 1.去勢組術后6周后血清雌二醇的濃度顯著低于假手術組(P0.05),去勢+雌激素組6周后血清雌二醇的濃度顯著高于去勢組(P0.05)。 2.去勢組大鼠喂養(yǎng)6周后皮膚組織各層的細胞萎縮,導管周圍的結(jié)締組織纖維增加并出現(xiàn)纖維化,部分腺泡失去正常結(jié)構(gòu),主要表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)排列紊亂,細胞體積變小,細胞核沒有明顯變化,細胞質(zhì)明顯減少,細胞核密集在一起,腺泡呈現(xiàn)出萎縮的狀態(tài)； 3.苦味酸-天狼猩紅法發(fā)現(xiàn)去勢組術后6周皮膚中Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例顯著低于假手術組(P0.05),去勢+雌激素組6周皮膚中Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例顯著高于去勢組(P0.05),而假手術組與去勢+雌激素組之間無統(tǒng)計學差異(P0.05)。 4.免疫組化法發(fā)現(xiàn)去勢組6周皮膚組織BMP-2蛋白表達明顯高于假手術組(P0.05),去勢+雌激素組皮膚組織中BMP-2蛋白水平明顯低于去勢組(P0.05)。 5.去勢組血清雌二醇水平與BMP-2蛋白表達有顯著負相關關系(r=-0.9600,P=0.0400)。 結(jié)論 去勢組大鼠6周后皮膚上皮細胞結(jié)構(gòu)紊亂,呈萎縮狀態(tài),功能減退,Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例明顯降低,BMP-2表達上調(diào),增加雌激素對膠原的降解,降低真皮的厚度及彈性,這可能是雌激素水平降低導致皮膚衰老的發(fā)病機制。 第二部分雌激素對體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞BMP-2表達的影響 目的 通過研究雌激素對體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞BMP-2蛋白的影響,探討雌激素減緩皮膚老化的機制。 方法 將皮膚標本,用含有抗生素的PBS液清洗皮膚組織的血液和污漬,剪去皮膚組織后,用0.25%胰蛋白酶消化清潔皮膚標本,4℃條件下作用14h,分離表皮和真皮組織,棄去表皮組織后,把其余的真皮組織用含1%膠原酶的37℃的MEM液,在5%二氧化碳培養(yǎng)箱中作用4h,以分離成纖維細胞,收集和洗滌所得的細胞,新分離出的成纖維細胞密度約4x104/mL,加入到含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待成纖維細胞生長成密集單層后,細胞密度約16x104/mE,以1：3的比例進行傳代,在孵化箱中培養(yǎng)48h,待細胞貼壁生長的細胞密度約達12x104/mL時,供后續(xù)的實驗使用。所有細胞都在無血清MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h,然后將將細胞分為4組：第1組為雌激素刺激組：分別向3個培養(yǎng)瓶中加入不同濃度的雌激素(1×10-1mol/L,1×10-2mol/L,1×10-3mol/L);第2組為Noggin拮抗組：分別向3個培養(yǎng)瓶中加入含不同濃度BMP2拮抗劑noggin (Noggin終濃度10,20,30μg/ml);第3組為雌激素刺激+noggin拮抗組：分別向3個培養(yǎng)瓶中加入含不同濃度的雌激素(雌激素終濃度分別為：1×10-1mol/L,1×10-2mol/L,1×10-3mol/L)+含不同濃度Noggin (Noggin終濃度10,20,30μg/mL)第4組為正常對照組：不做任何干預的體外培養(yǎng)皮膚成纖維細胞。取每組體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞中,采用Western blot檢測大鼠成纖維細胞中BMP2蛋白,以及免疫組化法觀察大鼠成纖維細胞中BMP2顆粒的多少,從而判斷BMP-2蛋白的表達水平。透射電鏡觀察不同雌激素濃度處理組對于成纖維細胞形態(tài)的影響。 結(jié)果 體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞,增殖活躍,形態(tài)表現(xiàn)良好,出現(xiàn)典型的梭形和柳葉形,用細胞計數(shù)法描繪細胞的生長曲線,結(jié)果顯示：潛伏期為0至2天,指數(shù)生長期為2～5天,然后進入平臺期。對成纖維細胞用雌二醇干預,免疫細胞化學的結(jié)果顯示低劑量組與對照組作比較,兩組的BMP-2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學差異,高劑量組的雌激素與對照組相比,高劑量組的雌激素組的BMP-2表達蛋白水平下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。透射電鏡下觀察到成纖維細胞體積變小,細胞質(zhì)減少,細胞核形態(tài)不規(guī)則,核染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮,出現(xiàn)在細胞核膜下的邊緣,由于不同的切片的染色質(zhì)凝集可以采取不同的形式在細胞核不同切面的位置,邊界清楚,核膜間隙寬度的變化不等。成纖維細胞超微結(jié)構(gòu)的主要病理顯示線粒體腫脹,線粒體嵴結(jié)構(gòu)損傷,顯示空泡或云霧狀的變化,胞質(zhì)內(nèi)可見許多髓樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論 高濃度的雌激素可以下調(diào)成纖維細胞BMP-2蛋白的表達水平,減少BMP-2對膠原的降解,但是低濃度的雌激素沒有此作用。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R751

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