本文關(guān)鍵詞：PD-1及CTLA-4單抗聯(lián)合腫瘤抗原激活I(lǐng)FN-γ陽(yáng)性效應(yīng)細(xì)胞治療B16惡性黑色素瘤的研究

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【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)通過在C57BL/6小鼠背部注射黑色素瘤細(xì)胞使小鼠荷瘤。將來源于小鼠骨髓的原始細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)成為成熟的負(fù)載黑色素瘤抗原的DC細(xì)胞后與小鼠脾臟來源的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),得到對(duì)腫瘤有特異性殺傷作用的T淋巴細(xì)胞,然后通過磁珠分選純化獲得能分泌產(chǎn)生IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞,將經(jīng)過磁珠分選得到的效應(yīng)細(xì)胞加入免疫檢查點(diǎn)抑制劑(PD-1和CTLA-4通路抑制劑)共同孵育半小時(shí)后,將獲得的效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)用于已經(jīng)荷瘤的小鼠體內(nèi)。檢測(cè)經(jīng)過磁珠純化加入免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境中的IL-10 m RNA、TGF-βm RNA表達(dá)的影響,流式檢測(cè)小鼠脾臟內(nèi)免疫抑制細(xì)胞(Tregs)的變化,相關(guān)組織病理切片觀察小鼠輸注效應(yīng)細(xì)胞后有無發(fā)生免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)免疫副反應(yīng),觀察各組荷瘤小鼠腫瘤體積大小變化情況、荷瘤小鼠生存期,探討免疫效應(yīng)細(xì)胞體外聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑(PD-1和CTLA-4通路抑制劑),能否在降低免疫檢查點(diǎn)抑制劑“去剎車效應(yīng)”而誘發(fā)的自身免疫反應(yīng)同時(shí)進(jìn)一步提高免疫抗腫瘤效應(yīng),以及本聯(lián)合方案在清除腫瘤免疫抑制微環(huán)境方面的作用及意義,為建立新一代具有更高療效的微環(huán)境干擾介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療技術(shù)提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法:1通過體外復(fù)蘇培養(yǎng)小鼠的惡性黑色素瘤B16細(xì)胞,然后向已經(jīng)脫毛的小鼠背部注射復(fù)蘇的B16細(xì)胞,使小鼠荷瘤。2負(fù)載B16黑色素瘤全腫瘤抗原的小鼠骨髓來源DC細(xì)胞的培養(yǎng):提取C57BL/6股骨脛骨骨髓細(xì)胞,向已經(jīng)貼壁的骨髓細(xì)胞中加入鼠源rm IL-4、rm GM-CSF和黑色素瘤細(xì)胞裂解后得到的腫瘤抗原,最后通過加入腫瘤壞死因子TNF-α使DC細(xì)胞成熟。3通過磁珠陽(yáng)性分選獲得效應(yīng)T淋巴細(xì)胞:將C57BL/6小鼠脾臟制備成細(xì)胞懸液,在得到的細(xì)胞懸液中加入淋巴細(xì)胞分離液分離后得到淋巴細(xì)胞,得到的淋巴細(xì)胞經(jīng)過尼龍毛柱的過濾獲得T淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)2天后,按比例加入負(fù)載腫瘤抗原的成熟DC細(xì)胞后混合共培養(yǎng)3-4天,即可得到活化的效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。將得到的活化的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞通過磁珠陽(yáng)性分選方法篩選其中能分泌IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。4免疫檢查點(diǎn)抑制劑與磁珠分選純化的細(xì)胞共孵育:將磁珠分選獲得的分泌IFN-γ陽(yáng)性的效應(yīng)T細(xì)胞加入PD-1和CTLA-4抑制劑,37°孵育半小時(shí)。5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療方法:將已經(jīng)荷瘤的小鼠完全隨機(jī)分為3個(gè)組,每個(gè)組40只。(A組)荷瘤對(duì)照組:向?qū)φ战M的荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml的生理鹽水;(B組)磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑細(xì)胞治療組:向荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射1×106個(gè)/0.2ml磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。(C組)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療組:每只荷瘤小鼠腹腔注射PD-1和CTLA-4抑制劑各20ug。觀察不同治療方法后各組荷瘤小鼠腫瘤體積大小的變化情況及生存期長(zhǎng)短。6在細(xì)胞治療后的第1、4、7、10、14天時(shí),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠以便提取各組荷瘤小鼠的腫瘤組織,實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)治療后不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤組織中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA表達(dá)的變化,比較通過不同治療方法,荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境中不同細(xì)胞因子表達(dá)的變化情況。7在細(xì)胞治療后的第7天取小鼠的脾臟制備成單細(xì)胞懸液,流式技術(shù)監(jiān)測(cè)治療后小鼠脾臟中Tregs細(xì)胞的含量,比較通過不同治療方法,對(duì)荷瘤小鼠脾臟中免疫抑制細(xì)胞的影響情況。8分別在細(xì)胞治療后的第1、4、7、14天,取小鼠肝、肺和小腸組織制備成病理切片,觀察病理形態(tài)學(xué)變化,以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑與效應(yīng)細(xì)胞體外共孵育后回輸至小鼠體內(nèi)后是否引起免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)免疫副作用:反應(yīng)性肝炎,腸炎和肺炎等。結(jié)果:1將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5×106個(gè)B16惡性黑色素瘤細(xì)胞接種于6-8周的小鼠背部皮下,6-7天后小鼠背部接種部位出現(xiàn)明顯的肉眼可見大小為0.5cm的皮下黑色瘤結(jié)節(jié);2將小鼠骨髓來源DC細(xì)胞培養(yǎng)至第6天,鏡下可見細(xì)胞由貼壁狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài),而且細(xì)胞由規(guī)則圓形形態(tài)變?yōu)榧?xì)胞表面有毛刺狀突起的成熟的DC細(xì)胞形態(tài),說明此時(shí)的DC細(xì)胞已經(jīng)具備了抗原提呈的能力;3各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化:單純注射PBS的對(duì)照組荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速,給予單純免疫檢查點(diǎn)抑制劑及磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效應(yīng)細(xì)胞治療組,小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢,腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于單純荷瘤組小鼠,磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑效應(yīng)細(xì)胞治療組的荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度略慢于單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療組的荷瘤小鼠腫瘤,倆個(gè)治療組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度在第7天到第20天相比對(duì)照組呈顯著降低的趨勢(shì);4各組小鼠生存期:A組(荷瘤對(duì)照組),B組(磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑組),C組(免疫檢查點(diǎn)抑制劑組)各組之間進(jìn)行生存期長(zhǎng)短的比較,各組的生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);5 RT-PCR法檢測(cè)治療后不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠腫瘤組織中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA表達(dá)的變化情況:在磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療組中小鼠腫瘤組織中的IL-10 m RNA、TGF-βm RNA的表達(dá)明顯低于荷瘤對(duì)照組(P0.05),單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑組也明顯低于荷瘤組(P0.05),但是磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療組與單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑組之間無明顯差別。磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療組中,腫瘤組織中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA出現(xiàn)了隨時(shí)間增加表達(dá)明顯下降的趨勢(shì),三組腫瘤組織中IL-10 m RNA、TGF-βm RNA的表達(dá)除了磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療組與單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑組均存在顯著性差異(P0.05);6細(xì)胞流式結(jié)果:我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了經(jīng)過治療的荷瘤小鼠的脾臟免疫細(xì)胞的亞群比例變化。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑效應(yīng)細(xì)胞治療和單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)治療均有效減少了免疫抑制細(xì)胞(Tregs)的比例與絕對(duì)數(shù),顯著提高了CD8+T細(xì)胞。但是倆個(gè)組之間對(duì)免疫抑制細(xì)胞的抑制作用無明顯差異;7病理切片結(jié)果:磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑組內(nèi)沒有出現(xiàn)反應(yīng)性肝炎,腸炎和肺炎等免疫檢查點(diǎn)的副反應(yīng);單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑組中部分出現(xiàn)反應(yīng)性肝炎,腸炎,肺炎和腹瀉等。結(jié)論:1相比于荷瘤對(duì)照組,磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑細(xì)胞治療組及單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度在7至25天明顯下降。磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑組的腫瘤生長(zhǎng)速度略慢于單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑組,說明磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑的效應(yīng)細(xì)胞能夠明顯的抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)展。2磁珠分選聯(lián)合免疫抑制劑治療與單純免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療都能夠有效延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存期,磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑細(xì)胞治療組的生存期略優(yōu)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑組,但是單獨(dú)應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑有幾率導(dǎo)致免疫相關(guān)反應(yīng),引起生存期明顯減少。3磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療后,腫瘤組織中IL-10m RNA、TGF-βm RNA的表達(dá)明顯下降,對(duì)IL-10 m RNA和TGF-βm RNA表達(dá)的影響與免疫檢查點(diǎn)抑制劑組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。4磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療及單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑均可以降低小鼠脾臟的免疫抑制細(xì)胞(Tregs)的數(shù)量,都可以有效的改變微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)。5磁珠分選聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑組治療后沒有引起單純應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑相關(guān)的肝炎,腸炎和肺炎等相關(guān)免疫副作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.5

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