本文關(guān)鍵詞：黑色素瘤惡性增殖分子標(biāo)記的細(xì)胞功能和分子機(jī)制研究

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【摘要】：目的:黑色素瘤(Melanoma)是一種源于皮膚、黏膜、眼和中樞神經(jīng)系統(tǒng)色素沉著區(qū)域的黑素細(xì)胞惡性腫瘤,其惡性程度高,預(yù)后極差。常規(guī)的治療方法(包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療等)雖然在一定程度上抑制了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,但均存在較大的治療弊端。例如,放射治療和化學(xué)治療會(huì)不可避免的引起嚴(yán)重的副反應(yīng),且大多數(shù)患者在不到一年內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生耐藥性。因此,目前亟需找到新的針對(duì)黑色素瘤的治療靶點(diǎn),以建立個(gè)性化的治療方案,提高患者生存率,延長(zhǎng)生存期。針對(duì)如何尋找影響黑色素瘤惡性增殖的功能基因,高通量(high-throughput)和高內(nèi)涵(high-content)的細(xì)胞篩選技術(shù)顯示出較大的應(yīng)用潛力,發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。通過(guò)在體外或體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞中將目的基因過(guò)表達(dá)或抑制其基因表達(dá),分析由基因表達(dá)水平上調(diào)/下調(diào)產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)通路和/或細(xì)胞功能表型改變,可初步了解基因的生物學(xué)功能。繼而可以通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床樣本的檢測(cè),進(jìn)一步了解基因的功能以及與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。方法:在本課題中,我們首先利用人類基因組寡核苷酸芯片,對(duì)3例惡性黑色素瘤新鮮組織和3例正常皮膚新鮮組織的全基因組表達(dá)譜進(jìn)行了比較,針對(duì)獲得的在黑色素瘤組織中表達(dá)上升的基因,選擇20個(gè)在腫瘤組織和正常組織差異倍數(shù)(fold change)大于5倍的分子,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q PCR)二次驗(yàn)證其表達(dá)水平。結(jié)合文獻(xiàn)篩選與黑色素瘤相關(guān)的基因,作為候選基因深入考察其與發(fā)病機(jī)制的關(guān)系。先使用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù),獲得目的基因敲除穩(wěn)定的黑色素瘤細(xì)胞株。接著利用MTT法和克隆形成測(cè)定法等驗(yàn)證目的基因敲除對(duì)黑色素瘤增殖情況的影響。隨后通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的分析和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè),探討目的基因在細(xì)胞分裂增殖過(guò)程中所發(fā)揮的作用和影響細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。最后針對(duì)其中一個(gè)分子,通過(guò)免疫組化方法,檢測(cè)其在58例黑素瘤組織和49例正常皮膚對(duì)照組織的表達(dá)差異,分析該分子陽(yáng)性表達(dá)與黑色素瘤臨床因素(性別、年齡、轉(zhuǎn)移等)的相關(guān)性。結(jié)果:1.針對(duì)黑色素瘤組織和正常皮膚新鮮組織進(jìn)行的基因表達(dá)譜篩選獲得了55個(gè)在腫瘤組織中的表達(dá)較正常組織的表達(dá)水平大于5倍基因,選擇差異倍數(shù)較大的前20個(gè)候選基因,q PCR驗(yàn)證其中有15個(gè)基因的表達(dá)情況均與芯片結(jié)果一致,即在黑色素瘤新鮮組織中,與正常新鮮組織比較,這些基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P0.05)。其中真核翻譯起始因子3D(eukaryotic translation initiation factor 3,subunit DEIF3D)、肌球蛋白V I(Myosin VI MYO6)和天冬酰胺合成酶(Asparagine Synthetase ASNS)的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。2.將表達(dá)EIF3D、MYO6和ASNSsh RNA的慢病毒分別感染黑色素瘤細(xì)胞株(A431和A375),感染3天后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)量達(dá)90%以上。與對(duì)照組相比,感染了慢病毒介導(dǎo)的特異性敲減EIF3D、MYO6和ASNS基因的sh RNA后,EIF3D、MYO6和ASNS的m RNA和蛋白水平均顯著降低(p0.05)。與對(duì)照組相比,EIF3D、MYO6和ASNS敲除組在慢病毒感染3天并繼續(xù)培養(yǎng)后,A431和A375細(xì)胞的增殖能力下降了75%以上(p0.05)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EIF3D、MYO6和ASNS敲除組單個(gè)6孔板內(nèi)克隆形成的數(shù)量降低了80%以上(p0.05),且單個(gè)集落中的黑色素瘤細(xì)胞數(shù)也顯著降低。PI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EIF3D通過(guò)調(diào)節(jié)A375細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)參與G2/M期調(diào)控,而MYO6、ASNS參與G0/G1期調(diào)控。Western blot結(jié)果顯示,EIF3D敲減的A375細(xì)胞中,細(xì)胞周期蛋白激酶CDK1、CDK2、CDK4,磷酸化的p53和細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑p27的表達(dá)水平均顯著降低。而細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1和細(xì)胞凋亡相關(guān)的PARP的表達(dá)均沒(méi)有發(fā)生顯著變化。3.免疫組化的結(jié)果表明,EIF3D在黑色素瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為100%,顯著高于在正常組織中的表達(dá)水平,但與患者的性別和年齡等臨床因素?zé)o關(guān)。以上結(jié)果提示,EIF3D、MYO6、ASNS三個(gè)分子尤其是EIF3D在黑色素瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用,它們可能是治療黑色素瘤的潛在有效治療靶點(diǎn)。結(jié)論:與黑色素瘤惡性增殖有關(guān)的分子-EIF3D、MYO6和ASNS,在黑色素瘤組織中特異性高表達(dá);慢病毒介導(dǎo)的sh RNA工具能夠在體外安全有效地抑制黑色素瘤細(xì)胞中EIF3D、MYO6和ASNS基因的表達(dá),繼而顯著抑制細(xì)胞的增殖能力。EIF3D、MYO6和ASNS基因有望作為基因治療的分子靶標(biāo)用于黑色素瘤的臨床診斷和靶向治療。后續(xù)還應(yīng)該通過(guò)裸鼠成瘤等動(dòng)物模型,進(jìn)一步驗(yàn)證基于EIF3D、MYO6和ASNS基因沉默的慢病毒工具是否是黑色素瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。以其中一個(gè)分子EIF3D為例,深入研究了其分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)EIF3D通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白,在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)黑色素瘤惡性增殖的表型。但其具體的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 李本尚;何映誼;羅長(zhǎng)纓;江華;沈樹(shù)紅;蔣黎敏;張蓓;顧龍君;;人白血病細(xì)胞株對(duì)L-門(mén)冬酰胺酶敏感性與門(mén)冬酰胺合成酶表達(dá)水平的相關(guān)性[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2010年03期

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本文編號(hào)：1154997