本文關(guān)鍵詞：降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對人血管內(nèi)皮細(xì)胞活化及分泌趨化因子調(diào)節(jié)作用的研究

  更多相關(guān)文章： 銀屑病 CGRP 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 趨化因子 ERK1/2

【摘要】：目的銀屑病是一種發(fā)病率較高的慢性炎癥性、自身免疫性皮膚病,其發(fā)病機(jī)制尚不明確,而神經(jīng)精神因素作為一個(gè)重要的誘發(fā)因素在銀屑病的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。目前研究表明,在與皮膚有關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)中,降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是與皮膚免疫細(xì)胞聯(lián)系較密切的神經(jīng)肽。本課題通過研究CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化并分泌相關(guān)趨化因子的影響以及可能的調(diào)節(jié)信號通路,進(jìn)一步揭示神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)異常在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。材料及方法1、留取新鮮的臍帶,采用胰酶消化法體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),經(jīng)M200培養(yǎng)液培養(yǎng)并傳至3-4代后,應(yīng)用不同濃度的CGRP(10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mo L)刺激內(nèi)皮細(xì)胞,分別于刺激后的第6h、12h及24h以PE標(biāo)記的CD62E單抗染色活化的內(nèi)皮細(xì)胞,未處理組為陰性對照組,TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞為陽性對照組,分別上機(jī)進(jìn)行流式檢測并選擇活化的最佳濃度及時(shí)間點(diǎn)(10-7mol/L,12h)。2、體外培養(yǎng)HUVEC,以10-7mol/L的CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞12h作為實(shí)驗(yàn)刺激組,預(yù)先加入MEK1/2拮抗劑作用1h后以10-7mol/L的CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞12h作為拮抗劑組,未刺激的內(nèi)皮細(xì)胞為對照組,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RQ-PCR)的方法分別檢測內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子CCL17、CCL22及CX3CL1的m RNA表達(dá)水平。3、體外培養(yǎng)HUVEC,以10-7mol/L的CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后留取上清作為實(shí)驗(yàn)刺激組,預(yù)先加入MEK1/2拮抗劑作用1h后以10-7mol/L的CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h作為拮抗劑組,未刺激的內(nèi)皮細(xì)胞為對照組,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測上清中趨化因子CCL17及CCL22的蛋白分泌情況。4、體外培養(yǎng)HUVEC,應(yīng)用10-7mol/L的CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞24h后,以未刺激的內(nèi)皮細(xì)胞為對照組,提取兩組貼壁細(xì)胞總蛋白,采用western-blot法檢測ERK1/2蛋白的磷酸化水平。結(jié)果:1、流式技術(shù)檢測細(xì)胞活化,CGRP刺激組內(nèi)皮細(xì)胞活化百分比及熒光強(qiáng)度均明顯升高,與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,最佳活化濃度及時(shí)間點(diǎn)為10-7mol/L,12h。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測趨化因子的m RNA表達(dá)水平,與對照組比較,刺激組CCL17及CCL22的m RNA水平均有明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);拮抗劑組CCL17及CCL22的m RNA升高水平較刺激組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);CX3CL1刺激組及拮抗劑組的m RNA水平較對照組升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3、ELISA法檢測細(xì)胞上清液中蛋白分泌水平,與對照組比較,刺激組上清中CCL17及CCL22的蛋白表達(dá)水平均有明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);拮抗劑組CCL17及CCL22的升高水平較刺激組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4、Western Blot法檢測ERK1/2蛋白磷酸化水平,實(shí)驗(yàn)組較對照組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、CGRP可以有效刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化,并且最佳活化的濃度及時(shí)間點(diǎn)為10-7mol/L,12h。2、通過m RNA水平及蛋白水平檢測,CGRP可以有效刺激內(nèi)皮細(xì)胞活化并分泌趨化因子CCL17及CCL22,而這一刺激作用可以通過拮抗MEK1/2信號通路而減弱。3、CGRP刺激內(nèi)皮細(xì)胞后,活化的內(nèi)皮細(xì)胞中ERK1/2蛋白的磷酸化水平有所升高。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 CGRP 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 趨化因子 ERK1/2
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 第一部分 CGRP對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活化作用的研究14-20
• 1、實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 2、實(shí)驗(yàn)方法15-17
• 3、結(jié)果17-19
• 4、結(jié)論19-20
• 第二部分 CGRP對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子CCL17、CCL22及CX3CL1的作用的研究20-34
• 實(shí)驗(yàn)一 CGRP對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子CCL17、CCL22及CX3CL1的mRNA表達(dá)的影響20-28
• 1、實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備20-21
• 2、實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 3、結(jié)果26-27
• 4、結(jié)論27-28
• 實(shí)驗(yàn)二 CGRP對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌趨化因子CCL17及CCL22的蛋白表達(dá)的影響28-34
• 1、實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備28-29
• 2、實(shí)驗(yàn)方法29-31
• 3、結(jié)果31-33
• 4、結(jié)論33-34
• 第三部分 CGRP對內(nèi)皮細(xì)胞 ERK1/2調(diào)節(jié)通路活化的研究34-40
• 1、實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 2、實(shí)驗(yàn)方法35-39
• 3、結(jié)果39
• 4、結(jié)論39-40
• 附：總技術(shù)路線40-41
• 討論41-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 文獻(xiàn)綜述55-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 英文縮略詞一覽表66-67
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況67-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人簡歷69

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本文編號：1036801