本文關鍵詞：利多卡因促進特應性皮炎Treg分化的作用及機制

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【摘要】：目的:研究利多卡因治療前后特應性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)患者外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)及小鼠模型皮損處調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T cell,Treg)的表達水平,并明確初始化CD4+T細胞向Treg的定向分化過程中利多卡因的調(diào)節(jié)作用及其信號通路,探索利多卡因治療AD的相關機制。方法:在體內(nèi),抽取20例AD患者利多卡因治療前后的外周血并分離PBMCs,RT-PCR法檢測Treg重要轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 mRNA的表達水平,并以流式細胞學技術(shù)檢測患者PBMCs中Treg(CD4+CD25highFoxP3+CD127low)細胞的比例及其他細胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17A,IL-17E mRNA水平的表達情況;使用卵清蛋白經(jīng)皮致敏Balb/C小鼠構(gòu)建AD模型,以尾靜脈注射利多卡因治療小鼠,流式細胞學技術(shù)檢測皮損處Treg細胞(CD4+FoxP3+)及脾臟、淋巴結(jié)的Treg細胞(CD4+CD25+FoxP3+Helios-)的表達水平,RT-PCR法檢測皮損處其他細胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17A,IL-17E mRNA的表達水平。在體外,采用磁珠分選法分離小鼠初始化CD4+T細胞,通過IL-2,TGF-β將其定向分化為treg,同時加入不同濃度的利多卡因,流式細胞學技術(shù)檢測treg細胞比例,使用cck8法測定細胞活性,提取總蛋白行westernblot檢測smads/tgf-β及nf-kb信號通路活化水平。結(jié)果:在體內(nèi),相較于治療前,利多卡因治療后ad患者pbmcs中foxp3mrna表達水平和treg細胞比例均明顯上升,且與皮損改善程度相一致;檢測患者pbmcs中各細胞因子mrna水平的表達,發(fā)現(xiàn)ifn-γ,il-4,il-17amrna水平顯著性升高,而il-17emrna水平顯著性下降。利多卡因治療后ad小鼠模型皮損嚴重度評分顯著下降,與其在組織病理學上的改變相一致,從動物實驗層面證實利多卡因?qū)d的治療有效;檢測小鼠皮損處各細胞亞群的炎癥因子水平,發(fā)現(xiàn)較生理鹽水治療組,利多卡因治療組小鼠皮損處的foxp3,ifn-γmrna及treg細胞水平上均顯著上升,il-4、il-17emrna水平明顯下降。體外treg誘導分化試驗中,研究發(fā)現(xiàn)利多卡因在一定濃度下(0.8mmol/l)可明顯提高treg細胞比例,且細胞活性未受影響。在利多卡因0.8mmol/l濃度下,其對treg的上調(diào)作用與smad3/tgf-β信號通路顯著相關,與nf-kb信號通路活化水平無關。結(jié)論:利多卡因在體內(nèi)可上調(diào)ad患者pbmcs及小鼠模型皮損中treg細胞的比例和foxp3mrna的表達水平,并調(diào)節(jié)部分細胞因子(ifn-γ/il-4和il-17a/il-17e)的表達失衡,在體外可促進treg細胞的分化作用,且該調(diào)控作用與smad3/tgf-β信號通路顯著相關,與nf-kb信號通路無關。
【關鍵詞】：利多卡因 特應性皮炎 調(diào)節(jié)性T細胞 分化
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R758.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略語12-13
• 中文部分13-65
• 第一部分 緒論13-16
• 第二部分 材料與方法16-37
• 2.1 研究對象16-19
• 2.1.1 人體相關試驗16-17
• 2.1.2 動物相關試驗17-19
• 2.2 收集方法19-20
• 2.2.1 AD患者樣本收集19
• 2.2.2 小鼠樣本收集19-20
• 2.3 細胞制備20-22
• 2.3.1 真皮細胞懸液的制備20
• 2.3.2 脾臟單個核細胞懸液的制備20-21
• 2.3.3 細胞凍存與復蘇21-22
• 2.4 試劑22-25
• 2.5 主要儀器及耗材25-26
• 2.6 實驗方法26-37
• 2.6.1 AD患者PBMCs的分離純化26
• 2.6.2 RT-PCR檢測26-29
• 2.6.3 Western-Blot檢測：29-31
• 2.6.4 磁珠分離法分離純化初始化CD4~+T細胞31-32
• 2.6.5 CCK-8 法檢測利多卡因?qū)π∈驝D4~+T細胞的細胞毒性32-33
• 2.6.6 定向誘導初始化CD4~+T細胞分化，并探究不同濃度利多卡因?qū)ζ涞挠绊?/span>33
• 2.6.7 流式細胞染色檢測細胞表達水平33-34
• 2.6.8 ELISA法檢測血清總IgE水平34-35
• 2.6.9 免疫組織化學染色檢測35-36
• 2.6.10統(tǒng)計學分析36-37
• 第三部分 結(jié)果37-51
• 3.1 利多卡因靜脈封閉治療AD患者的作用37-41
• 3.1.1 利多卡因可明顯改善AD患者皮損嚴重程度37-38
• 3.1.2 利多卡因治療后的AD患者PBMCs中的Treg關鍵轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 mRNA水平和Treg細胞(CD4~+CD25highFoxP3+CD127low)的比例均明顯上升38-39
• 3.1.3 利多卡因?qū)θ梭wPBMCs中其他細胞因子的調(diào)節(jié)作用39-41
• 3.2 利多卡因治療卵清蛋白誘導的AD小鼠的作用41-48
• 3.2.1 成功采用卵清蛋白經(jīng)皮致敏誘導AD小鼠模型41-44
• 3.2.2 利多卡因治療對皮損中FoxP3 mRNA和皮損、脾臟、淋巴結(jié)的Treg的表達水平的影響44-47
• 3.2.3 利多卡因?qū)π∈笃渌毎蜃拥恼{(diào)節(jié)作用47-48
• 3.3 利多卡因治療特應性皮炎的機制研究48-51
• 3.3.1 利多卡因在一定濃度下可上調(diào)初始化T細胞定向誘導為Treg的比例48-49
• 3.3.2 利多卡因?qū)τ赥reg的上調(diào)作用與Smad3 /TGF-β 信號通路顯著相關49-51
• 第四部分 討論51-57
• 4.1 AD患者PBMCs與小鼠皮損處Treg細胞的表達情況51-52
• 4.2 Treg細胞水平與其他細胞因子表達水平的關系52-55
• 4.3 利多卡因促進Treg細胞分化的機制研究55-57
• 第五部分 結(jié)論57-58
• 第六部分 參考文獻58-61
• 致謝61-63
• 攻讀學位期間發(fā)表的相關論文63-65
• 英文部分65-117
• Part One Introduction67-71
• Part Two Materials and Methods71-94
• 2.1 Subjects71-74
• 2.1.1 Human Trials71-73
• 2.1.2 Animal Experiments73-74
• 2.2 Sample Collection74-75
• 2.3 Cells75-77
• 2.3.1 Preparation of murine dermal cells suspension75
• 2.3.2 Preparation of murine spleenocytes75-76
• 2.3.3 Freezing and anabiosis of cells76-77
• 2.4 Reagent Preparation of main reagent77-79
• 2.5 Primary instruments and consumable items79-80
• 2.6 Methods80-94
• 2.6.1 Isolation of PBMCs80-81
• 2.6.2 RT-PCR81-84
• 2.6.3 Western-Blot84-87
• 2.6.4 Purification of Naive CD4~+ T cells87-89
• 2.6.5 Analysis of lidocaine cytotoxicity on murine CD4~+ T Cells89-90
• 2.6.6 In vitro Treg cells differentiation90
• 2.6.7 Flow cytometry90-91
• 2.6.8 Serum total Ig E detection91-92
• 2.6.9 Immunohistochemistry92-93
• 2.6.10 Statistical Analysis93-94
• Part Three Results94-108
• 3.1 Effect of lidocaine therapy on AD pateints94-97
• 3.1.1 Lidocaine therapy significantly ameliorated AD patients’ lesional severity94-95
• 3.1.2 Lidocaine therapy enhanced the percentage of Treg cells and promoted Fox P3 m RNAexpression in both AD patients95-96
• 3.1.3 Lidocaine regulated other cytokines in PBMCs of AD patients96-97
• 3.2 Effect of Lidocaine on the murine OVA-sensitized AD models97-105
• 3.2.1 OVA-sensitized murine AD models were successfully established97-100
• 3.2.2 Lidocaine could up-regulate Fox P3 m RNA expression and the proportion of Treg cells indermis of leisional skin but not in spleen and lymoh nodes100-104
• 3.2.3 Modulation of lidocaine on other cytokines in murine models104-105
• 3.3 Mechanism of lidocaine promotion on the differentiation of Treg cells in AD105-108
• 3.3.1 Lidocaine could up-regulated the proportion of Treg at the concentration of 0.8mmol/L105-106
• 3.3.2 The up-regulation of Treg cells by lidocaine was significantly relevant with Smad3/TGF-βsignaling pathway106-108
• Part Four Discussion108-114
• 4.1 Treg expression in PBMCs of AD patients and murine lesional skins108-110
• 4.2 The relationship between Treg cells and other cytokines110-113
• 4.3 The mechanism of lidocaine promotion on the differentiation of Treg cells113-114
• Part Five Conclusion114-115
• Part Six References115-117

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫海霞;法呢基硫代水楊酸對哮喘小鼠氣道炎癥，，氣道重塑和Th細胞分化的影響及其機制的初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 戴鱺瑤;水楊酸對皮膚屏障功能的影響及其臨床應用的研究[D];大連醫(yī)科大學;2013年

2 邱盼盼;特應性皮炎患兒外周血轉(zhuǎn)錄因子RORγ t與Foxp3表達的研究[D];濱州醫(yī)學院;2012年

本文編號：1036768