本文關鍵詞：TNFAIP3在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B細胞的作用初步研究

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【摘要】：[研究背景]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是可引起多系統(tǒng)、多器官損傷炎癥的自身免疫性疾病,以T、B細胞免疫功能異常,產生多種自身抗體(如抗核抗體、抗dsDNA抗體、抗磷脂抗體)、發(fā)生引起漿膜炎、關節(jié)炎、血管炎腎小球腎炎等炎癥損傷的自身免疫復合物為特點。病變涉及皮膚、黏膜、心臟、腎臟、肝臟和血液系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等多個組織和器官。迄今為止,未有任何研究明確SLE的發(fā)病機制及病因,但經過多項研究證明SLE目前與環(huán)境(如強烈陽光)、激素、病毒感染、免疫、遺傳、藥物等多種因素有關。而綜合各科研表明,SLE是一種呈非孟德爾遺傳方式為主的多基因病,遺傳因素在SLE誘導因素中占主要地位。近幾年,多項候選基因研究及全基因組關聯(lián)研究(Genome-wide association study, GWAS)已證實,在中國漢族SLE患者中,TNFAIP3為其易感基因之一。7NFAIP3可抑制Toll樣受體(TLR)和腫瘤壞死因子(TNF)受體誘導的核因子kappa-B (NF-κB)活性以及TNF介導的程序性細胞死亡(PCD),最終抑制NF-κ-B的強度,終止NF-κB介導的促炎癥反應,進而抑制B細胞的缺陷凋亡以及活化過度,可能在SLE等自身免疫性疾病的發(fā)病機制中起到重要作用。[目 的]1.構建出含TNFAIP3基因的重組逆轉錄病毒表達載體,并能在哺乳類動物中良好地高效表達。2、分別過表達SLE患者及正常對照者外周血B細胞TNFAIP3基因,檢測過表達該基因對B細胞生長、存活及對其它基因TLR7、TLR9、BAFF-R表達的影響。通過本課題實驗研究探討TNFAIP3基因在SLE患者B細胞TLR7、TLR、BAFF-R潛在的關聯(lián),以及TNFAIP3對SLE疾病潛在的作用機制及其臨床意義,為深度研究TNFAIP3基因在SLE的發(fā)病機制、病情加重因素中起到的生物學功能及免疫調節(jié)作用打下良好的基礎,同時也能夠為SLE病情活動提供新的診斷思路,也為SLE的治療提供更好的途徑。[方法]1.構建含TNFAIP3基因的逆轉錄病毒表達載體TNFAIP3-pBABEpuro。2.收集SLE患者30例及健康對照30例,采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法并使用人外周血淋巴細胞分離液分離SLE患者及健康人外周血淋巴細胞,運用免疫磁珠分選方法分選CD19+ B淋巴細胞,待用。3、選用293T細胞來對TNFAIP3-pBABEpuro、pBABE進行慢病毒包裝質粒,待培養(yǎng)48h后收集病毒上清液,并將其加入至盛有預先分選出的SLE患者及健康人的B淋巴細胞的培養(yǎng)板中,24h換液一次,待感染48h后收集細胞,從收集的B細胞中提取RNA,然后將RNA反轉錄為cDNA；最后使用Real-time PCR實時熒光定量PCR技術檢測過表達TNFAIP3的SLE病人以及健康人B淋巴細胞中TNFAIP3其mRNA表達水平,B細胞中TLR7、TLR9、BAFF-R mRNA的表達情況；最后采用MTT法實驗檢測過表達TNFAIP3基因后B淋巴細胞存活的影響。[結果]1.成功構建了含TNFAIP3基因的重組逆轉錄病毒表達載體,并證實了其能在哺乳動物細胞中較高表達。2、分別過表達SLE患者及正常對照者B細胞TNFAIP3基因,均得出過表達質粒感染組(TNFAIP3-pBABE)較其對照組(pBABE), TNFAIP3 mRNA的表達明顯增高,且具有顯著性的差異(P0.01)。不管是過表達SLE患者,還是正常對照B細胞中TNFAIP3基因,均可使該基因在mRNA水平明顯上調,且在SLE患者B細胞該基因上調更高。3、正常對照及SLE患者,過表達質粒感染組(TNFAIP3-pBABE)均較其對照組(pBABE),TLR7 mRNA的表達明顯降低,且具有顯著性的差異(P0.01)。且SLE患者TLR7表達下調的程度較正常對照更明顯。4、正常對照及SLE患者,過表達質粒感染組(TNFAIP3-pBABE)均較其對照組(pBABE), TLR9 mRNA的表達明顯升高,差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與正常對照相比,過表達SLE患者B細胞TNFAIP3基因,其T LR9 mRNA表達上調更明顯。5、外源性過表達外周血B細胞TNFAIP3基因,可使B細胞中TNFAIP3基因的表達上調,同時該基因的表達也影響了B細胞中BAFF-R mRNA表達,使其著顯上調。6、過表達SLE患者及正常對照B細胞中TNFAIP3基因后,對B細胞的生長存活影響無明顯影響。[結論]1. TNFAIP3異常表達提示該基因在SLE免疫發(fā)病機制中起著重要的調節(jié)作用。2TNFAIP3可能通過調節(jié)受體后信號通路轉導影響TLR介導的信號途徑、影響TLR、BAFF-R的表達。3.TNFAIP3基因不影響B(tài)細胞的生長、存活。[研究意義]該研究探討TNFAIP3基因對SLE的發(fā)生、發(fā)展的影響,對SLE發(fā)病機制具有重要的研究指導意義,為SLE發(fā)病機制提供了理論依據(jù)。在應用上,為SLE的治療提供新的靶點,進一步闡明了對SLE的在基因層面行治療的可能性
【關鍵詞】：紅斑狼瘡/系統(tǒng)性 B淋巴細胞 TNFAIP3 過表達
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R593.241
【目錄】：

• 英文縮寫詞5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-20
• 1. 系統(tǒng)性紅斑狼瘡概述13-16
• 2. TNFAWB基因概述16-17
• 3. NF-kB概述17-20
• 第一章 TNFAIP3-pBABEpuro逆轉錄病毒表達載體的構建及鑒定20-36
• 1.1 主要技術路線20
• 1.2 實驗材料20-21
• 1.3 實驗方法21-32
• 1.4 實驗結果32-35
• 1.5 小結35-36
• 第二章 過表達TNFAIP3對SLE患者外周血B細胞的影響36-52
• 2.1 主要技術路線36
• 2.2 實驗材料36-38
• 2.3 實驗方法38-43
• 2.4 實驗結果43-50
• 2.5 小結50-52
• 討論52-59
• 結論59-60
• 實驗不足之處60-61
• 參考文獻61-68
• 綜述68-76
• 參考文獻73-76
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的文章及科研項目情況76-77
• 致謝77-78

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7 郭穎P，

本文編號：748255