本文關(guān)鍵詞：DNA去甲基化增強(qiáng)人牙周膜干細(xì)胞成骨能力并逆轉(zhuǎn)其在高糖環(huán)境下受損的成骨潛能

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【摘要】：第一部分I型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建及其牙周膜甲基化水平檢測(cè)目的:建立I型糖尿病大鼠模型,檢測(cè)其牙槽骨骨量變化及牙周膜中DNA甲基化程度。方法:30只8周齡雄性SD大鼠,隨機(jī)分為兩組分別注射鏈脲佐霉素(Streptozotocin,STZ,60mg/kg)和檸檬酸鈉(1 m L/kg)。成功建立糖尿病大鼠模型后,分別選取兩組中大鼠下頜骨及磨牙、牙周膜等周?chē)徑M織行micro CT檢測(cè)骨量變化。同時(shí)運(yùn)用免疫組化手段檢測(cè)糖尿病大鼠牙周膜中5甲基胞嘧啶(5-m C)含量以表征其甲基化程度。結(jié)果:糖尿病大鼠與對(duì)照組大鼠相比牙槽骨骨量明顯減少,并且牙周膜中5-m C含量明顯增加。結(jié)論:I型糖尿病大鼠模型表現(xiàn)出牙槽骨減少及牙周膜甲基化程度增高的臨床表征。第二部分體外人牙周膜干細(xì)胞的獲得和鑒定目的:分離及培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs),檢測(cè)其多向分化能力和間充質(zhì)細(xì)胞表征。方法:采用12位年齡在14-18周歲臨床接受正畸拔牙矯治患者所拔除健康前磨牙,刮取牙周膜組織并采用組織塊酶消化法以獲得目的細(xì)胞。檢測(cè)其多向分化能力;通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞角蛋白(CK14)和波形絲蛋白(Vimentin)以驗(yàn)證其間充質(zhì)細(xì)胞特性;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)間充質(zhì)細(xì)胞表面抗原以排除造血細(xì)胞、單核細(xì)胞等混入對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成影響。結(jié)果:獲得的h PDLSCs能成功誘導(dǎo)出礦化結(jié)節(jié)、脂滴及神經(jīng)細(xì)胞樣突起;Vimentin染色陽(yáng)性,CK14染色陰性;流式檢測(cè)沒(méi)有出現(xiàn)造血或單核等其他來(lái)源的細(xì)胞。結(jié)論:經(jīng)鑒定,分離出的目的細(xì)胞具有多向分化能力并為間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞。第三部分DNA甲基化抑制劑5-aza-d C在高糖環(huán)境下對(duì)h PDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影響目的:明確甲基化抑制劑在高糖環(huán)境下對(duì)h PDLSCs甲基化程度及成骨向分化能力的影響。方法:通過(guò)向培養(yǎng)液中加入葡萄糖(30m M)、DNA甲基化抑制劑5-aza-d C(1μM),將人牙周膜干細(xì)胞隨機(jī)分為四組:高糖組、抑制劑組、高糖加抑制劑組及對(duì)照組。在成骨誘導(dǎo)液中分別培養(yǎng)4天后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)(Real-time RT-PCR)檢測(cè)高糖組和對(duì)照組甲基化相關(guān)基因(Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b)變化,并分別于3天和7天提取四組DNA行整體甲基化水平檢測(cè)。檢測(cè)四組細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3天及7天時(shí)堿性磷酸酶(ALP)活性,茜素紅染色檢驗(yàn)四組細(xì)胞體外培養(yǎng)2周后礦化結(jié)節(jié)形成狀況,提取四組細(xì)胞3天和7天時(shí)的m RNA和總蛋白,RT-PCR檢測(cè)成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因(ALP、OCN、OPN和OSX)的表達(dá)情況,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)骨向分化相關(guān)蛋白(ALP、OPN和OSX)的表達(dá)情況。結(jié)果:高糖組Dnmts的表達(dá)及DNA整體甲基化程度較對(duì)照組明顯升高,抑制劑組降低DNA甲基化程度的同時(shí)能降低高糖環(huán)境下升高的甲基化程度;在成骨誘導(dǎo)條件下,抑制劑組相較于其他三組在ALP活性、礦化結(jié)節(jié)形成量、成骨向分化標(biāo)志基因及蛋白表達(dá)(ALP、OCN/OCN、OPN/OPN、OSX/OSX)均明顯增高,高糖和抑制劑組檢測(cè)指標(biāo)次之,高糖組檢測(cè)指標(biāo)均最低。結(jié)論:在高糖環(huán)境中,h PDLSCs的甲基化程度升高并伴隨著成骨向分化能力的減弱,DNA甲基化抑制劑5-aza-d C能逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下被削弱的成骨潛能。第四部分5-aza-d C通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)h PDLSCs在高糖環(huán)境下受損的成骨能力目的:探討經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與高糖環(huán)境下5-aza-d C調(diào)控h PDLSCs成骨分化過(guò)程中的機(jī)制。方法:Western blot分別于3天和7天檢測(cè)高糖組、抑制劑組、高糖加抑制劑組和對(duì)照組中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中胞內(nèi)信號(hào)分子β-catenin(non-p active)和p-GSK-3β以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因Lef1表達(dá)量;加入經(jīng)典Wnt通路胞外抑制劑DKK1(100ng/ml),采用Western blot分別于1天和3天檢測(cè)抑制劑組、DKK1組、高糖組、抑制劑加DKK1組、高糖加抑制劑組、高糖加DKK1組以及高糖加抑制劑及DKK1共處理組成骨向分化標(biāo)志蛋白(ALP、OPN和OSX)的表達(dá)情況。結(jié)果:高糖組中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子水平表達(dá)降低,抑制劑組中相關(guān)因子表達(dá)升高并可逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);加入DKK1后,h PDLSCs成骨向分化標(biāo)志蛋白表達(dá)量降低,DKK1加抑制劑組以及高糖和抑制劑及DKK1組成骨向分化標(biāo)志蛋白表達(dá)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:5-aza-d C通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)h PDLSCs在高糖環(huán)境下受損的成骨能力。
【關(guān)鍵詞】：高糖 DNA甲基化 人牙周膜干細(xì)胞 經(jīng)典Wnt信號(hào)通路 成骨向分化
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1;R781
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 前言14-15
• 第一部分 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建及其牙周膜甲基化水平檢測(cè)15-23
• 1 材料和方法16-18
• 2 結(jié)果18-20
• 3 討論20-22
• 結(jié)論22-23
• 第二部分 人牙周膜干細(xì)胞的獲得和鑒定23-30
• 1 材料和方法23-27
• 2 結(jié)果27-29
• 3 討論29-30
• 結(jié)論30
• 第三部分 DNA甲基化抑制劑 5-aza-d C在高糖環(huán)境下對(duì)h PDLSCs甲基化程度及成骨分化能力的影響30-42
• 1 材料和方法31-37
• 2 結(jié)果37-40
• 3 討論40-42
• 結(jié)論42
• 第四部分 5-aza-d C通過(guò)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)h PDLSCs在高糖環(huán)境下受損的成骨能力42-49
• 1 材料和方法43-44
• 2 結(jié)果44-47
• 3 討論47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-59
• 英漢縮略詞對(duì)照表59-60
• 致謝60-62
• DNA甲基化對(duì)干細(xì)胞多向分化的調(diào)控及其機(jī)制(綜述)62-75
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 附件75-77

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 毛釗;影響牙周膜細(xì)胞生物學(xué)功能的相關(guān)因素[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2003年06期

2 凌均h，

本文編號(hào)：689954