發(fā)布時間：2017-08-07 21:32

  本文關(guān)鍵詞：橋本氏甲狀腺炎中IL-23通過抑制細胞自噬誘導(dǎo)ROS累積的研究

  更多相關(guān)文章： 橋本氏甲狀腺炎 IL-23 自噬 ROS AKT mTOR

【摘要】：目的:本文旨在探討在橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)患者中白細胞介素23(interlukin-23,IL-23)是否參與甲狀腺氧化還原平衡紊亂以及ROS累積,其機制是否與誘導(dǎo)細胞自噬異常有關(guān)。方法:1.采用免疫組織化學(xué)法檢測10例HT和10例單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的甲狀腺組織中IL-23、IL-23R表達。2.采用免疫熒光染色技術(shù)觀察經(jīng)不同濃度IFN-γ(250 U/mL、500 U/mL、1000 U/mL)或不同濃度LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/m L)或不同濃度TNF-α(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)處理后甲狀腺上皮細胞Nthy-ori 3-1中IL-23R的表達變化。3.甲狀腺上皮細胞株Nthy-ori 3-1用不同濃度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)單獨處理或用特異性IL-23中和抗體預(yù)處理后再與IL-23(50 ng/mL)共同處理后,采用免疫熒光以及流式細胞術(shù)檢測甲狀腺上皮細胞內(nèi)ROS水平的變化。4.采用免疫組織化學(xué)法檢測橋本甲狀腺炎以及單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者的甲狀腺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達。5.Western blot檢測甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)單獨處理不同時間(8min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h)或50 ng/ml IL-23與其特異性中和抗體(1μg/mL)共同作用后自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12、p62表達變化。6.采用免疫熒光技術(shù)檢測不同濃度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)處理甲狀腺上皮細胞24 h后p-mTOR表達變化。7.Western blot檢測甲狀腺上皮細胞經(jīng)IL-23(50 ng/mL)處理不同時間(8 min、15min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h)后AKT、p-AKT以及mTOR、p-mTOR蛋白表達變化。8.甲狀腺上皮細胞在含有或不含有il-23特異性中和抗體(1μg/ml)預(yù)處理的培養(yǎng)基中與il-23(50ng/ml)處理后,采用westernblot檢測p-mtor以及mtor蛋白表達變化。9.westernblot檢測甲狀腺上皮細胞nthy-ori3-1經(jīng)不同濃度雷帕霉素(10nm、20nm、50nm)處理不同時間段(12h、24h)后p-mtor表達水平變化。10.westernblot檢測細胞經(jīng)il-23(50ng/ml)與雷帕霉素(10nm)不同組合處理后自噬相關(guān)蛋白lc3b-ii、atg12以及p62表達變化。11.采用免疫熒光以及流式細胞術(shù)檢測雷帕霉素的加入對甲狀腺上皮細胞內(nèi)ros表達水平的影響。12.免疫組化檢測橋本甲狀腺炎以及單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者甲狀腺組織中p-akt、akt以及p-mtor、mtor的表達。結(jié)果:1.橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺組織中il-23以及il-23r表達明顯高于正常對照組。2.體外實驗結(jié)果顯示,nthy-ori3-1經(jīng)ifn-γ(250u/ml、500u/ml、1000u/ml)以及l(fā)ps(0.1μg/ml、0.5μg/ml濃度)處理后細胞表面il-23r的表達量均明顯上調(diào),但不同濃度tnf-α處理組il-23r表達水平與對照組無明顯差異。3.nthy-ori3-1經(jīng)不同濃度il-23處理后其細胞內(nèi)ros表達水平明顯增強,il-23中和抗體的加入減少了il-23誘導(dǎo)的細胞內(nèi)ros的增加。4.免疫組化結(jié)果顯示,在橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺組織中自噬相關(guān)蛋白lc3b、atg12表達明顯低于正常對照組;體外實驗顯示,甲狀腺上皮細胞經(jīng)il-23處理后其自噬相關(guān)蛋白lc3b、atg12表達明顯下調(diào)及p62蛋白表達上調(diào)(p0.01);相反,il-23中和抗體的加入使得自噬相關(guān)蛋白lc3b(p0.05)、atg12(p0.01)表達明顯上調(diào)及p62表達明顯下調(diào)(p0.01)。5.免疫熒光結(jié)果顯示,il-23處理甲狀腺上皮細胞后引發(fā)磷酸化mtor表達水平增加且具有一定濃度依賴性;采用westernblot技術(shù)在蛋白水平進一步驗證,結(jié)果顯示Nthy-ori 3-1經(jīng)IL-23處理不同時間后AKT以及mTOR的磷酸化水平明顯上調(diào)(P0.05),加入IL-23中和抗體后則p-mTOR表達水平明顯下降(P0.05)。6.Western blot結(jié)果顯示,10 nM雷帕霉素處理甲狀腺上皮細胞24 h時,明顯下調(diào)了mTOR以及p-mTOR水平。7.Western blot結(jié)果顯示,與IL-23單獨處理組相比,雷帕霉素的加入使得自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達明顯上調(diào)及p62蛋白表達明顯下調(diào);免疫熒光以及流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,與IL-23單獨處理組相比,雷帕霉素的加入明顯下調(diào)了ROS的表達(P0.01)。8.免疫組化結(jié)果顯示,與健康對照組相比,橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞中p-AKT以及p-mTOR表達水平明顯上調(diào),然而在正常對照組以及橋本甲狀腺炎患者中總的AKT以及mTOR表達水平?jīng)]有明顯的差異。結(jié)論:綜上所述,我們的結(jié)果顯示橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞中IL-23表達明顯增高;IL-23通過活化AKT/mTOR信號通路抑制甲狀腺上皮細胞自噬活性,自噬的抑制導(dǎo)致ROS水平的累積并進一步加劇橋本甲狀腺炎疾病進程。因此,采用IL-23特異性中和抗體抑制IL-23或者雷帕霉素抑制mTOR的表達均明顯反轉(zhuǎn)了甲狀腺上皮細胞自噬表型,且體外實驗結(jié)果顯示其相關(guān)蛋白的變化與橋本甲狀腺炎患者甲狀腺組織中蛋白變化較為一致,推測IL-23作為關(guān)鍵致病因子,與橋本甲狀腺炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),從而為阻止橋本甲狀腺炎中甲狀腺上皮細胞氧化損傷提供了潛在的治療策略。
【關(guān)鍵詞】：橋本氏甲狀腺炎 IL-23 自噬 ROS AKT mTOR
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R581.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 英文縮略詞16-19
• 第一章 緒論19-25
• 1.1 自身免疫性甲狀腺疾病19-20
• 1.1.1 自身免疫性甲狀腺疾病簡介19
• 1.1.2 橋本氏甲狀腺炎19-20
• 1.1.2.1 橋本氏甲狀腺炎主要病理特征19-20
• 1.1.2.2 主要臨床表現(xiàn)20
• 1.1.2.3 研究現(xiàn)狀20
• 1.2 活性氧20-22
• 1.2.1 活性氧簡介20-21
• 1.2.2 活性氧與炎癥21
• 1.2.3 活性氧與橋本氏甲狀腺炎21-22
• 1.3 自噬22-23
• 1.3.1 自噬簡介22
• 1.3.2 自噬與自身免疫性疾病22-23
• 1.3.3 自噬與橋本氏甲狀腺炎23
• 1.4 白細胞介素 2323-25
• 1.4.1 細胞因子與橋本氏甲狀腺炎23-24
• 1.4.2 IL-23 與自身免疫性疾病24
• 1.4.3 IL-23 與橋本氏甲狀腺炎24-25
• 第二章 研究目的、內(nèi)容、方法、意義及實驗方案設(shè)計25-27
• 2.1 研究目的25
• 2.2 研究內(nèi)容25
• 2.3 研究方法及技術(shù)25
• 2.4 研究意義25
• 2.5 實驗方案設(shè)計25-27
• 2.5.1 橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺組織與正常甲狀腺組織中IL-23、IL-23R以及自噬相關(guān)蛋白Atg12、LC3B、p-AKT、AKT、p-m TOR、m TOR的表達情況25-26
• 2.5.2 IL-23 對甲狀腺上皮細胞株Nthy-ori 3-1 自噬及細胞內(nèi)ROS水平的影響及其分子機制的研究26-27
• 第三章 實驗材料與方法27-41
• 3.1 臨床標本收集27
• 3.1.1 橋本甲狀腺炎及正常對照組甲狀腺組織標本27
• 3.2 主要試劑和材料27-33
• 3.2.1 細胞株27
• 3.2.2 相關(guān)抗體及主要試劑27-32
• 3.2.2.1 細胞培養(yǎng)試劑27-28
• 3.2.2.2 蛋白提取試劑28-29
• 3.2.2.3 Western blot主要抗體及相關(guān)試劑29-31
• 3.2.2.4 免疫組化、免疫熒光相關(guān)試劑31-32
• 3.2.2.5 實驗相關(guān)檢測試劑盒32
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備和耗材32-33
• 3.3 實驗方法33-40
• 3.3.1 免疫組織化學(xué)34-35
• 3.3.2 細胞培養(yǎng)35
• 3.3.3 細胞內(nèi)活性氧檢測35-37
• 3.3.4 免疫熒光37-38
• 3.3.5 免疫印跡38-40
• 3.4 統(tǒng)計學(xué)分析40-41
• 第四章 實驗結(jié)果41-55
• 4.1 HT甲狀腺組織中IL-23 以及IL-23R表達情況的研究41-42
• 4.2 IFN-γ、LPS促進甲狀腺上皮細胞IL-23R的表達42-43
• 4.3 IL-23 促進甲狀腺上皮細胞中ROS的積聚43-45
• 4.4 IL-23 抑制甲狀腺上皮細胞自噬45-48
• 4.4.1 橋本氏甲狀腺炎患者甲狀腺組織中自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg12表達水平明顯下降45-46
• 4.4.2 IL-23 抑制甲狀腺上皮細胞自噬46-47
• 4.4.3 添加靶向結(jié)合IL-23 的特異性中和抗體前后自噬變化47-48
• 4.5 IL-23 通過活化AKT/m TOR信號通路抑制甲狀腺上皮細胞自噬活性48-52
• 4.5.1 IL-23 上調(diào)甲狀腺上皮細胞AKT/m TOR信號通路相關(guān)蛋白的表達48-49
• 4.5.2 添加IL-23 特異性中和抗體前后p-m TOR的變化49-50
• 4.5.3 IL-23 通過活化m TOR信號通路抑制甲狀腺上皮細胞自噬50-52
• 4.5.3.1 雷帕霉素作用濃度及時間50-51
• 4.5.3.2 雷帕霉素的加入逆轉(zhuǎn)了IL-23 誘導(dǎo)的甲狀腺上皮細胞自噬水平的下降51-52
• 4.6 雷帕霉素下調(diào)IL-23 誘導(dǎo)的ROS的累積52-53
• 4.7 橋本氏甲狀腺炎患者的甲狀腺上皮細胞內(nèi)AKT/m TOR信號高度活化53-55
• 第五章 討論55-57
• 第六章 主要結(jié)論及展望57-58
• 6.1 主要結(jié)論57
• 6.2 展望57-58
• 參考文獻58-68
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與參加的會議68-70
• 致謝70-71

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