本文關(guān)鍵詞：氧化苦參堿對(duì)高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗和脂代謝影響的研究

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【摘要】：隨著現(xiàn)代生活水平的提高,肥胖的發(fā)病率日趨增加,而胰島素抵抗(insulin resistance,IR)作為肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、非酒精性脂肪肝等多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ),已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。氧化苦參堿是從中藥苦參中提取的一種單體成分,既往研究表明氧化苦參堿具有抗炎、抗腫瘤、抗纖維化及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)功能,近來(lái)研究表明氧化苦參堿與二甲雙胍聯(lián)合治療可顯著改善NAFLD患者的肝功能,明顯減輕肝臟脂質(zhì)沉積,增強(qiáng)其胰島素敏感性,但具體機(jī)制尚不明確。本研究擬在體外細(xì)胞水平,通過(guò)觀察氧化苦參堿對(duì)高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR和脂代謝的影響,探討其改善IR和脂代謝的分子機(jī)制,為臨床用藥提供理論依據(jù)。目的:觀察中藥制劑氧化苦參堿對(duì)高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR和脂質(zhì)沉積的影響,從胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、脂代謝及氧化應(yīng)激方面探討其分子機(jī)制。方法:采用高脂(含0.25 mmol/L棕櫚酸培養(yǎng)基)誘導(dǎo)法建立HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗模型。將HepG2細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組和高脂干預(yù)組,分別干預(yù)24小時(shí)后,利用葡萄糖氧化酶法測(cè)定培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度,并計(jì)算葡萄糖消耗率,判定造模是否成功。造模成功后將高脂干預(yù)組隨機(jī)分為5組,分別為高脂組(Pa)、二甲雙胍組(Met)(二甲雙胍濃度0.20 mg/m L)、氧化苦參堿低劑量組(Omt-L)(氧化苦參堿濃度為0.04mg/m L)、氧化苦參堿中劑量組(Omt-M)(氧化苦參堿濃度為0.08 mg/m L)和氧化苦參堿高劑量組(Omt-H)(氧化苦參堿濃度為0.16 mg/m L),同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組(N)。分別干預(yù)48小時(shí)后收集細(xì)胞,采用相應(yīng)試劑盒測(cè)定各組HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo),即谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量;DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)熒光染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的含量;油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積程度;Real-Time PCR檢測(cè)HepG2細(xì)胞胰島素信號(hào)通路上INSR、IRS-1、Akt及GLUT4與脂代謝通路上SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1、CPT-1及CD36的m RNA表達(dá)水平;Western Blot檢測(cè)HepG2細(xì)胞GLUT4、CD36、FAS、ACC及SCD-1蛋白的表達(dá)水平,以及IRS-1和Akt的總蛋白及磷酸化蛋白水平。結(jié)果:1 HepG2細(xì)胞IR體外模型的建立HepG2細(xì)胞經(jīng)高脂干預(yù)24小時(shí)后,Pa組葡萄糖含量較N組升高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示胰島素敏感性下降,表明棕櫚酸誘導(dǎo)IR體外細(xì)胞模型建立成功。2 MTT法觀察藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響與N組相比,棕櫚酸干預(yù)24h能夠使HepG2細(xì)胞增殖抑制率上升,抑制率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Pa組相比,Met、Omt-L、Omt-M、Omt-H均能降低HepG2細(xì)胞增殖抑制率(P0.05),但未能恢復(fù)至N組水平,而Omt-H2組則使HepG2細(xì)胞增殖抑制率明顯升高,從而選取Omt-L、Omt-M、Omt-H三組的藥物濃度為氧化苦參堿干預(yù)濃度。3 HepG2細(xì)胞胰島素敏感性的變化3.1胰島素信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)基因表達(dá)水平的變化與N組相比,Pa組HepG2細(xì)胞INSR、IRS-1、Akt、GLUT4的m RNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Pa組相比,Met、Omt-M、Omt-H組干預(yù)后明顯上調(diào)GLUT4的m RNA表達(dá),與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05),并且同時(shí)上調(diào)IRS-1、Akt、INSR的m RNA表達(dá)(P0.05),但未能恢復(fù)至N組水平;Omt-L可上調(diào)Akt及INSR的m RNA表達(dá),但未恢復(fù)至N組水平(P0.05),同時(shí)明顯上調(diào)GLUT4的m RNA表達(dá)(P0.05),此外,Omt-L組干預(yù)后可上調(diào)IRS-1的表達(dá),但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.2胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵分子的蛋白表達(dá)水平變化與N組相比,Pa組p-IRS-1/IRS-1的比值顯著升高,p-Akt/Akt與GLUT4/β-actin均顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Pa組相比,二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組中p-IRS-1/IRS-1的比值顯著減低,而p-Akt/Akt、GLUT4/β-actin均顯著增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但p-Akt/Akt的比值未能恢復(fù)至正常水平。4.1藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)TG含量測(cè)定結(jié)果顯示高脂干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加(P0.05);與Pa組相比,二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組HepG2細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯降低(P0.05)。4.2棕櫚酸干預(yù)后HepG2細(xì)胞內(nèi)脂代謝相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的變化與N組相比,Pa組SREBP-1c、FAS、ACC、SCD-1及CPT-1的m RNA表達(dá)水平明顯下降,CD36的m RNA表達(dá)水平明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與N組相比,SREBP-1c、FAS、ACC及SCD-1在Pa組的蛋白表達(dá)明顯降低,同時(shí),CD36蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.3藥物干預(yù)后脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化關(guān)鍵因子的變化與Pa組相比,二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組CD36的m RNA水平顯著降低(P0.05),其蛋白表達(dá)明顯下降(P0.05);與Pa組相比,二甲雙胍及氧化苦參堿不同劑量干預(yù)組CPT-1的m RNA表達(dá)顯著升高(P0.05);5藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響5.1活性氧(ROS)含量與N組相比,Pa組細(xì)胞內(nèi)ROS的含量顯著增加;二甲雙胍及不同劑量的氧化苦參堿干預(yù)后可以顯著降低ROS含量。5.2抗氧化酶T-SOD、GSH-Px及脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的含量HepG2細(xì)胞經(jīng)棕櫚酸干預(yù)后,抗氧化酶GSH-Px、T-SOD的活性較N組均顯著下降(P0.05),脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的含量明顯增加(P0.05),不同劑量氧化苦參堿及二甲雙胍干預(yù)后,細(xì)胞內(nèi)MDA較Pa組明顯減少(P0.05),T-SOD及GSH-Px的活性較Pa組明顯增高(P0.05),而藥物干預(yù)組組間沒(méi)有明顯差異(P0.05)。結(jié)論:1氧化苦參堿可作用于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路,減輕高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞IR。2氧化苦參堿可通過(guò)抑制長(zhǎng)鏈脂肪酸的吸收及增加游離脂肪酸的β氧化而改善高脂干預(yù)所致的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。3氧化苦參堿可改善高脂誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài),減少ROS4藥物干預(yù)對(duì)HepG2細(xì)胞脂代謝的影響生成,降低MDA含量,恢復(fù)抗氧化酶GSH-Px及T-SOD的活性,進(jìn)而改善HepG2細(xì)胞糖脂代謝。
【關(guān)鍵詞】：胰島素抵抗 氧化苦參堿 脂質(zhì)沉積 氧化應(yīng)激 HepG2細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫(xiě)13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-32
• 結(jié)果32-35
• 附圖35-45
• 附表45-47
• 討論47-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 綜述 代謝性炎癥反應(yīng)與胰島素抵抗關(guān)系研究進(jìn)展57-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 致謝65-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 Vandana Saini;;Molecular mechanisms of insulin resistance in type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2010年03期

2 余小虎;朱金水;顧國(guó)妹;施建平;;氧化苦參堿聯(lián)合二甲雙胍對(duì)非酒精性脂肪肝患者胰島素抵抗及血清TNFα的影響[J];臨床肝膽病雜志;2007年03期

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本文編號(hào)：599186