發(fā)布時間：2017-07-25 14:45

  本文關鍵詞：外源性鈣對氟致小鼠成骨細胞增殖及Wnt信號通路的影響

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【摘要】：[目的]通過檢測Wnt通路抑制劑和不同水平鈣對氟中毒小鼠成骨細胞增殖過程中Wnt信號通路相關基因和蛋白表達水平的變化,探究氟致小鼠成骨細胞增殖的作用機理以及適當劑量的鈣對氟中毒的緩解作用,為有效防治氟中毒提供理論依據。[方法]取出生24h內的小鼠顱骨,采用階段性酶消化法分離純化培養(yǎng)細胞,經HE、吉姆薩、堿性磷酸酶和鈣化結節(jié)染色鑒定為成骨細胞后,進行成骨細胞的傳代,取第三代生長狀況良好的小鼠成骨細胞隨機分為7組。每組進行如下處理：對照組(C)用正常DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng),攻氟組(F)分別添加10-8、10-7、10-6、10-5、10-4mol/L濃度的氟化鈉,氟加抑制劑組(F+Y)添加10-6mol/L的氟化鈉和5μg/mL的Wnt通路抑制劑DKK1,抑制劑組(Y)添加5μg/mL的DKK1,氟加低鈣組(F+Cal)在攻氟組培養(yǎng)液中添加1mmol/L的氯化鈣,氟加中鈣組(F+Call)在攻氟組培養(yǎng)液中添加2mmol/L的氯化鈣,氟加高鈣組(F+Calll)在攻氟組培養(yǎng)液中添加4mmol/L的氯化鈣。試驗周期為24h。使用MTT法檢測成骨細胞增殖情況,使用real-time PCR技術檢測成骨細胞Wnt信號通路相關基因的表達水平,使用細胞免疫熒光、激光共聚焦、Western blotting技術檢測成骨細胞Wnt信號通路相關蛋白的表達水平。[結果]1.本試驗采用酶消化法成功從小鼠顱骨中分離出細胞并培養(yǎng),利用HE、吉姆薩、堿性磷酸酶、茜素紅多種染色法鑒定所培養(yǎng)細胞為成骨細胞。2.10-8、10-7、10-6mol/L的氟對小鼠成骨細胞增殖有顯著促進作用,10-5mol/L的氟對小鼠成骨細胞增殖的促進作用不顯著,10-4mol/L的氟對小鼠成骨細胞增殖有抑制作用。3.體外培養(yǎng)小鼠成骨細胞24h時,氟對其增殖率影響最顯著。4.Wnt通路抑制劑明顯抑制了氟致小鼠成骨細胞的增殖。5.10-6mol/L的氟能夠促進小鼠成骨細胞中Wnt3a、β-Catenin、C-myc基因mRNA水平的表達,添加2mmol/L的鈣有效抑制了氟致小鼠成骨細胞增殖相關基因的表達。6.10-6mol/L的氟能夠促進小鼠成骨細胞中β-Catenin、Wnt3a、C-myc和CyclinD1蛋白的表達,抑制GSK3β蛋白的表達,添加2mmol/L的鈣有效抑制了氟致小鼠成骨細胞增殖相關蛋白的表達。[結論]10-6mol/L的氟通過激活Wnt信號通路促進小鼠成骨細胞增殖,補充2mmol/L的鈣能有效緩解氟對成骨細胞的毒性作用。
【關鍵詞】：氟 鈣 成骨細胞 增殖 Wnt通路
【學位授予單位】：山西農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R595;R68
【目錄】：

• 摘要7-9
• 文獻綜述9-12
• 前言12-13
• 第一章 體外小鼠成骨細胞的培養(yǎng)和鑒定13-23
• 1 材料與方法13-16
• 1.1 試驗材料13-14
• 1.2 試驗方法14-16
• 1.3 數據統(tǒng)計16
• 2 試驗結果16-20
• 2.1 小鼠成骨細胞的原代培養(yǎng)16-17
• 2.2 小鼠成骨細胞的傳代培養(yǎng)17
• 2.3 小鼠成骨細胞的鑒定17-18
• 2.4 不同氟濃度對體外培養(yǎng)小鼠成骨細胞增殖的影響18-19
• 2.5 Wnt通路抑制劑(DKK1)對體外培養(yǎng)氟致小鼠成骨細胞增殖率的影響19-20
• 3 討論與分析20-22
• 3.1 小鼠成骨細胞的原代分離及其傳代培養(yǎng)20-21
• 3.2 小鼠成骨細胞的鑒定21
• 3.3 不同氟濃度對體外培養(yǎng)小鼠成骨細胞增殖的影響21-22
• 3.4 DKK1對體外培養(yǎng)氟致小鼠成骨細胞增殖率的影響22
• 4 小結22-23
• 第二章 不同劑量鈣對氟致小鼠成骨細胞增殖Wnt通路相關基因的影響23-33
• 1 材料與方法23-28
• 1.1 試驗材料23-24
• 1.2 試驗方法24-27
• 1.3 數據統(tǒng)計27-28
• 2 試驗結果28-30
• 2.1 RNA的完整性和純度28
• 2.2 不同劑量鈣和DKK1對氟致小鼠成骨細胞增殖基因表達的影響28-30
• 3 討論與分析30-32
• 4 小結32-33
• 第三章 不同劑量鈣對氟致小鼠成骨細胞增殖Wnt通路相關蛋白的影響33-44
• 1 材料與方法33-38
• 1.1 試驗材料33-35
• 1.2 試驗方法35-38
• 1.3 數據統(tǒng)計38
• 2 試驗結果38-42
• 2.1 激光共聚焦檢測氟致小鼠成骨細胞增殖β-Catenin蛋白表達的影響38-39
• 2.2 免疫熒光檢測不同劑量鈣和DKK1對小鼠成骨細胞增殖Wnt3a蛋白表達的影響39-40
• 2.3 免疫熒光檢測不同劑量鈣和DKK1對小鼠成骨細胞增殖CyclinD1蛋白表達的影響40
• 2.4 Western blotting檢測不同劑量鈣和DKK1對氟致小鼠成骨細胞增殖GSK3β蛋白表達量的影響40-41
• 2.5 Western blotting檢測不同劑量鈣和DKK1對氟致小鼠成骨細胞增殖C-myc蛋白表達量的影響41
• 2.6 Western blotting檢測不同劑量鈣和DKK1對氟致小鼠成骨細胞增殖β-Catenin蛋白表達量的影響41-42
• 3 討論與分析42-43
• 4 小結43-44
• 全文結論44-45
• 參考文獻45-51
• Abstract51-53
• 致謝53

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本文編號：571759