本文關(guān)鍵詞：MICU1下調(diào)介導(dǎo)的線粒體鈣攝取障礙在糖尿病心肌病發(fā)生中的作用及機(jī)制

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【摘要】：【研究背景】糖尿病是以代謝紊亂為主要特征的一種慢性疾病,其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,嚴(yán)重威脅人類的健康。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一,更是糖尿病心血管病患者預(yù)后不良的重要原因。DCM主要以心肌左室收縮和(或)舒張功能障礙為特征,若治療不當(dāng),會導(dǎo)致心律失常、心源性休克、心力衰竭,嚴(yán)重者甚至發(fā)生猝死。因此,對糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制及防治措施的研究意義重大。線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致的線粒體功能紊亂被認(rèn)為是糖尿病心肌病發(fā)生的重要病理機(jī)制。但是,糖尿病狀態(tài)下心肌線粒體鈣攝取降低的具體分子機(jī)制至今仍不清楚。近年來陸續(xù)有多篇關(guān)于細(xì)胞線粒體鈣攝取機(jī)制的研究原著發(fā)表在Nature、Cell、Cell Metabolism等高水平雜志上,鑒定出線粒體鈣離子單向轉(zhuǎn)運蛋白(MCU,mitochondrial calcium uniporter)、線粒體鈣離子攝入蛋白1(MICU1,mitochondrial calcium uptake1)等調(diào)控線粒體鈣攝取的關(guān)鍵分子。MCU定位在線粒體內(nèi)膜形成孔道,而MICU1具有兩個典型的EF手形結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)可感知鈣離子的變化,可能作為MCU正向調(diào)節(jié)蛋白發(fā)揮作用。有意思的是,研究發(fā)現(xiàn)MICU1功能喪失導(dǎo)致的線粒體鈣紊亂參與兒童特定類型的大腦疾病和肌肉疾病發(fā)生,提示MICU1功能受損與線粒體相關(guān)疾病存在密切關(guān)系。然而,MICU1是否參與了糖尿病心肌線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控,進(jìn)而影響糖尿病心肌病的發(fā)生?國內(nèi)外尚未見報道。因此,本研究旨在闡明MICU1在糖尿病心肌病中所發(fā)揮的作用,并深入探討其具體機(jī)制,期望為臨床治療糖尿病心肌病提供新的思路。【研究目的】1)明確MICU1在糖尿病心肌病中的表達(dá)變化及在糖尿病心肌病發(fā)展中的作用。2)探討MICU1調(diào)控糖尿病心肌病發(fā)生的分子機(jī)制。3)初步探討MICU1在糖尿病小鼠心臟中表達(dá)下調(diào)的機(jī)制�！狙芯糠椒ā�1.MICU1在糖尿病心肌病中的表達(dá)變化及在糖尿病心肌病發(fā)展中的作用。采用不同周齡db/db糖尿病小鼠和對照組小鼠,通過免疫印跡實驗、實時定量PCR及免疫組化方法對MICU1的表達(dá)進(jìn)行檢測。利用心肌點注射腺病毒上調(diào)MICU1的表達(dá)水平。體式熒光顯微鏡驗證腺病毒心肌點注射效果同時評估心臟體積大小,并采用免疫印記方法對MICU1的表達(dá)進(jìn)一步檢測。通過小動物超聲檢測小鼠心臟功能,利用免疫印記方法及實時定量PCR方法檢測MICU1及其相關(guān)分子的表達(dá)水平,免疫組化方法檢測其表達(dá)及定位。通過心臟重量、心重/脛骨長度比、心肌橫截面積(CSA)及α-MHC、β-MHC、ANF的m RNA表達(dá)檢測小鼠心肌肥厚。制作冰凍切片,利用mito SOX染色檢測心肌組織水平ROS的變化。采用免疫印記方法檢測心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase3及caspase9的蛋白表達(dá)。2.MICU1下調(diào)促進(jìn)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。在H9C2心肌細(xì)胞中,使用高糖高脂培養(yǎng)(33mmol/L葡萄糖+0.5mmol/L棕櫚酸鈉)24h,利用腺病毒及si RNA干涉分別上調(diào)及下調(diào)MICU1的表達(dá)水平后,通過免疫印跡實驗檢測心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase3、caspase9及Cyto-c的蛋白表達(dá),運用流式細(xì)胞術(shù)對免疫印記實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。通過TMRM染色檢測心肌細(xì)胞膜電位的改變,在利用線粒體靶向小清蛋白清除線粒體鈣的基礎(chǔ)上,利用線粒體鈣染料Rhod-2對心肌細(xì)胞線粒體鈣攝取能力進(jìn)行檢測,利用mito SOX染色檢測心肌細(xì)胞水平ROS的改變。利用PDH活性試劑盒,α-KGDH活性檢測試劑盒,NAD+/NADH檢測試劑盒,NADP+/NADPH檢測試劑盒及GSH/GSSG檢測試劑盒檢測心肌細(xì)胞抗氧化能力。3 MICU1在糖尿病小鼠心臟中表達(dá)降低的機(jī)制。利用生物信息學(xué)方法對MICU1的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了初步預(yù)測。利用CHIP實驗對預(yù)測結(jié)果進(jìn)一步驗證,并在細(xì)胞水平分別上調(diào)和下調(diào)SP1的表達(dá)后檢測MICU1的表達(dá)水平,并檢測db/db糖尿病小鼠心肌組織SP1的表達(dá),同時利用GSE數(shù)據(jù)庫中的芯片數(shù)據(jù)分析SP1與MICU1的相關(guān)性。【研究結(jié)果】1.周齡為6周的db/db糖尿病小鼠心肌組織中MICU1表達(dá)無顯著改變,飼養(yǎng)至12周時,MICU1的表達(dá)水平顯著低于對照組,且隨著周齡的增大表達(dá)逐漸降低。上調(diào)MICU1的表達(dá)可顯著抑制心肌組織ROS的生成,減輕心肌細(xì)胞凋亡,顯著增強(qiáng)心臟收縮功能,提高α-MHC的表達(dá)表達(dá)水平,同時降低β-MHC及ANF的表達(dá)水平,減小心肌橫截面積,抑制心肌細(xì)胞肥大,從而顯著延緩糖尿病心肌病的發(fā)展。2.高糖高脂培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞系24h后可顯著下調(diào)MICU1的表達(dá)。下調(diào)MICU1的表達(dá)會顯著降低線粒體鈣攝取能力,降低心肌細(xì)胞線粒體膜電位,增加ROS的生成,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。反之,上調(diào)MICU1可提高線粒體鈣攝取能力,提高心肌細(xì)胞線粒體膜電位,抑制心肌細(xì)胞線粒體ROS的生成進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡。3.生物信息學(xué)分析預(yù)測MICU1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為SP1。CHIP實驗發(fā)現(xiàn)在MICU1第一個外顯子前1個堿基的位置,SP1與MICU1發(fā)生特異性結(jié)合。在細(xì)胞水平分別上調(diào)和下調(diào)SP1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)MICU1的表達(dá)隨SP1的改變而改變,通過檢測db/db糖尿病小鼠心肌組織SP1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)在6周齡時表達(dá)無變化,飼養(yǎng)至12周時SP1的表達(dá)較對照組出現(xiàn)顯著降低,且隨周齡增長表達(dá)逐漸下降,與MICU1在db/db糖尿病小鼠心肌中的表達(dá)趨勢相一致,同時利用GSE數(shù)據(jù)庫中的芯片分析發(fā)現(xiàn)SP1與MICU1的表達(dá)呈正相關(guān)�！窘Y(jié)論】1.發(fā)現(xiàn)MICU1在糖尿病心肌中表達(dá)降低,并隨著糖尿病心肌病加重其表達(dá)進(jìn)一步下降。在db/db糖尿病小鼠心肌中上調(diào)MICU1的表達(dá)可顯著降低心肌細(xì)胞橫截面積,減輕心臟重量及降低心重/脛骨長度比值,從而顯著延緩糖尿病心肌病心肌肥厚的發(fā)展。同時上調(diào)MICU1的表達(dá)可抑制心肌組織ROS生成,降低心肌細(xì)胞的凋亡。2.MICU1可通過增強(qiáng)線粒體鈣攝取能力抑制心肌細(xì)胞線粒體ROS的生成進(jìn)而減輕高糖高脂引起的心肌細(xì)胞凋亡。3.糖尿病心肌MICU1的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子SP1的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病心肌病 MICU1 線粒體 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-17
• 文獻(xiàn)回顧17-28
• 第一部分 MICU1在糖尿病心肌病中的作用28-50
• 1 材料28-30
• 1.1 實驗動物及細(xì)胞28
• 1.2 主要試劑28-29
• 1.3 主要儀器29-30
• 2 方法30-42
• 2.1 動物實驗實施方案30
• 2.2 心臟石蠟切片制備30-31
• 2.3 心肌組織免疫組化檢測MICU1的表達(dá)及定位31-33
• 2.4 構(gòu)建心肌點注射腺病毒過表達(dá)MICU1小鼠模型33-34
• 2.5 體式熒光顯微鏡觀察腺病毒熒光表達(dá)34
• 2.6 小動物超聲檢測心臟功能34
• 2.7 心臟重量及心重/脛骨長度34
• 2.8 體式熒光顯微鏡觀察觀察心肌大體樣本34-35
• 2.9 心臟冰凍切片制備35
• 2.10 心肌組織麥胚凝集素染色檢測心肌細(xì)胞橫截面積35
• 2.11 心肌組織Mito SOX?染色檢測心肌細(xì)胞線粒體ROS的生成35-36
• 2.12 Western blot檢測心肌組織MICU1、caspase3及caspase9的蛋白表達(dá)水平36-39
• 2.13 實時定量PCR檢測不同周齡心肌組織MICU1及 α-MHC、β-MHC、ANF的m RNA表達(dá)水平39-41
• 2.14 統(tǒng)計學(xué)分析41-42
• 3 結(jié)果42-48
• 3.1 糖尿病小鼠心肌組織MICU1的表達(dá)下調(diào)42-43
• 3.2 心肌點注射腺病毒模型成功構(gòu)建43-44
• 3.3 MICU1改善糖尿病心肌病的心臟功能44
• 3.4 MICU1抑制糖尿病心肌肥厚，減緩糖尿病心肌病的發(fā)展44-47
• 3.5 MICU1抑制線粒體ROS生成，，減少心肌細(xì)胞凋亡47-48
• 4 討論48-50
• 第二部分 MICU1下調(diào)促進(jìn)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究50-71
• 1 材料50-52
• 1.1 實驗動物及細(xì)胞50
• 1.2 主要試劑50-51
• 1.3 主要儀器51-52
• 2 方法52-62
• 2.1 細(xì)胞實驗分組52-54
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)所需液體的配制54
• 2.3 H9C2心肌細(xì)胞系的培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇54-55
• 2.4 腺病毒感染H9C2心肌細(xì)胞系55-56
• 2.5 si RNA轉(zhuǎn)染實驗56-57
• 2.6 Western Blot檢測心肌細(xì)胞MICU1、PV、caspase3、caspase9和Cyto-c的蛋白表達(dá)水平57-58
• 2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡58-59
• 2.8 TMRM檢測心肌細(xì)胞膜電位59
• 2.9 Rhod-2 檢測心肌細(xì)胞線粒體鈣靜態(tài)及鈣瞬變59-60
• 2.10 Mito SOX~(?)染色檢測心肌細(xì)胞線粒體ROS的生成60
• 2.11 PDH活性檢測試劑盒檢測心肌細(xì)胞PDH活性60-61
• 2.12 α-KGDH活性檢測試劑盒檢測心肌細(xì)胞PDH活性61
• 2.13 NAD~+/NADH及NADP~+/NADPH在心肌細(xì)胞中的檢測61
• 2.14 心肌細(xì)胞GSH/GSSG的檢測61-62
• 2.15 統(tǒng)計學(xué)分析62
• 3 結(jié)果62-68
• 3.1 下調(diào)MICU1促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡62-63
• 3.2 上調(diào)MICU1抑制心肌細(xì)胞凋亡63-64
• 3.3 MICU1通過促進(jìn)線粒體鈣攝取抑制ROS，減輕高糖高脂誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡64-66
• 3.4 MICU1介導(dǎo)的線粒體鈣攝取通過提高線粒體抗氧化能力抑制ROS生成66-67
• 3.5 MICU1通過MCU促進(jìn)線粒體鈣攝取抑制心肌細(xì)胞凋亡67-68
• 4 討論68-71
• 第三部分 MICU1在糖尿病小鼠心臟中表達(dá)降低的機(jī)制71-81
• 1 材料71-73
• 1.1 實驗動物及細(xì)胞71
• 1.2 主要試劑71-72
• 1.3 主要儀器72-73
• 2 方法73-78
• 2.1 MICU1啟動子序列分析73
• 2.2 染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch IP）73-76
• 2.3 細(xì)胞實驗實施方案76-77
• 2.4 Western Blot檢測MICU1和SP1的蛋白表達(dá)水平77
• 2.5 實時定量PCR檢測心肌組織MICU1及SP1的m RNA表達(dá)水平77
• 2.6 利用基因芯片分析SP1與MICU1的相關(guān)性77
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)分析77-78
• 3 結(jié)果78-80
• 3.1 SP1直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)MICU1的表達(dá)78-79
• 3.2 組織水平MICU1的表達(dá)與SP1呈正相關(guān)79-80
• 4 討論80-81
• 小結(jié)81-82
• 參考文獻(xiàn)82-92
• 個人簡歷和研究成果92-93
• 致謝93

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