本文關(guān)鍵詞：葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）的泛素化調(diào)控介導(dǎo)糖尿病腎病足細(xì)胞的損傷

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【摘要】：第一部分高糖通過增加G6PD的泛素化降解降低足細(xì)胞內(nèi)G6PD的表達(dá)目的：觀察高糖高脂對足細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞骨架以及氧化還原的影響,過表達(dá)G6PD能否改善,以及研究G6PD泛素化修飾的情況。方法：檢測高糖高脂培養(yǎng)下足細(xì)胞體內(nèi)cleaved caspase-3的表達(dá)；檢測高糖培養(yǎng)下足細(xì)胞體內(nèi)NADPH、GSH/GSSG、細(xì)胞內(nèi)ROS聚集情況；利用MTT方法檢測高糖培養(yǎng)對足細(xì)胞的增殖的影響；利用鬼筆環(huán)肽熒光染色的方法檢測高脂培養(yǎng)下足細(xì)胞F-actin排列的情況：利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建pCDNA3.0-Flag-G6PD質(zhì)粒。足細(xì)胞按照實驗?zāi)康姆纸M,正常葡萄糖(NG,5.6mmol/L)、高濃度葡萄糖(HG,25mmol/L)、高濃度葡萄糖同時加過表達(dá)G6PD腺病毒(HG/Ad2)及高濃度葡萄糖同時加空載腺病毒(HG/Laz);BSA對照、500μmol/L棕櫚酸、500μmol/L棕櫚酸加G6PD腺病毒、500μmol/L棕櫚酸加空載腺病毒。HEK293T細(xì)胞按照實驗?zāi)康姆纸M：His-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；His-Ub和Flag-G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組；His-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染+MG132(20uM)組：His-Ub和Flag-G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染+MG132(20uM)組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48小時之后,RIPA裂解液裂解細(xì)胞,用Anti-Flag beads富集細(xì)胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白,用His的抗體進(jìn)行G6PD泛素化的檢測。Input樣品利用Westernblot方法及抗體檢測相應(yīng)的蛋白。結(jié)果：1、高糖高脂引起的足細(xì)胞的凋亡,能夠被過表達(dá)的G6PD所改善。2、高脂培養(yǎng)能夠使足細(xì)胞的F-actin骨架紊亂和氧化還原的失衡,G6PD過表達(dá)則能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。3、通過質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù),成功構(gòu)建pCDNA3.0-Flag-G6PD質(zhì)粒。4、與其他組相比,His-Ub和Flag-G6PD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染+MG132組能夠顯著增加G6PD的泛素化修飾。結(jié)論：過表達(dá)G6PD可以部分逆轉(zhuǎn)高糖高脂對足細(xì)胞增殖、凋亡、形態(tài)和氧化還原的影響以及高糖通過泛素蛋白酶體途徑降低足細(xì)胞內(nèi)G6PD的表達(dá)。第二部分VHL參與G6PD泛素蛋白酶體途徑的降解目的：查找并驗證介導(dǎo)G6PD泛素化降解的E3酶。方法：利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù),構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.0-HA-VHL。利用酵母雙雜交技術(shù)成功的篩選參與G6PD的泛素化的E3酶。免疫共沉淀實驗,]HEK293T細(xì)胞按照實驗?zāi)康姆譃?個組：HA-VHL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、Flag-G6PD和HA-VHL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。兩組在轉(zhuǎn)染的最后6小時均加入MG132(20uM),Co-IP裂解液裂解細(xì)胞,用Anti-Flag beads富集細(xì)胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白,用HA的抗體檢測HA-VHL蛋白。體內(nèi)泛素化實驗,HEK293T細(xì)胞按照實驗?zāi)康姆譃?組：His-Ub質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；Flag-G6PD和His-Ub質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組：Flag-G6PD、His-Ub和HA-VHL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組。在轉(zhuǎn)染的最后6小時均加入MG132(20uM),RIPA裂解液裂解細(xì)胞,用Anti-Flag beads富集細(xì)胞裂解液中Flag-G6PD的蛋白,用His的抗體進(jìn)行G6PD泛素化的檢測。Input樣品利用Westernblot方法及抗體檢測相應(yīng)的蛋白。結(jié)果：1、利用質(zhì)粒構(gòu)建技術(shù),成功構(gòu)建質(zhì)粒pCDNA3.0-HA-VHL。2、利用酵母雙雜交實驗篩選出與G6PD相互作用的E3酶-VHL(Von Hippel-Lindau tumor suppressor) o3、利用免疫共沉淀(Co-IP)方法,證明了G6PD和VHL的體內(nèi)結(jié)合。4、體內(nèi)泛素化實驗證明VHL能夠增加細(xì)胞內(nèi)泛素化的G6PD蛋白。結(jié)論：VHL是參與G6PD泛素化降解的E3泛素連接酶。
【關(guān)鍵詞】：G6PD 足細(xì)胞 高糖高脂 泛素蛋白酶體途徑 G6PD 泛素蛋白酶體途徑 E3泛素連接酶 VHL
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R692.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 序言10-14
• 參考文獻(xiàn)11-14
• 第一部分 高糖通過增加G6PD的泛素化降解降低足細(xì)胞內(nèi)G6PD的表達(dá)14-32
• 引言14
• 材料和方法14-24
• 結(jié)果24-27
• 討論27-29
• 參考文獻(xiàn)29-32
• 第二部分 VHL參與G6PD泛素蛋白酶體途徑的降解32-51
• 引言32
• 材料與方法32-42
• 結(jié)果42-45
• 討論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-51
• 結(jié)論51-52
• 綜述52-58
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文及科研成果58-59
• 致謝59-60

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