本文關(guān)鍵詞：晚期糖基化終末產(chǎn)物處理的成纖維細胞中TGF-β1通過Egr-1調(diào)控細胞外基質(zhì)生成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景糖尿病足潰瘍(Diabetes foot ulceration)糖尿病(Diabetes mellitus)常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。目前,糖尿病足潰瘍的治療主要手段是創(chuàng)面換藥及護理、下肢大血管重建及外科清創(chuàng)及截肢手術(shù),然而,這些治療手段并未取得很好的效果,因此,研究糖尿病足潰瘍的病理過程及尋找其難愈的機制,尋找新的治療手段,是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的熱點及難點。創(chuàng)面愈合是一個復(fù)雜的過程,其中涉及多種細胞類型、細胞外基質(zhì)的分泌功能、各種生長因子及細胞素的相互作用。皮膚成纖維細胞(Dermal fibroblast),是皮膚組織中的主要細胞成分,是創(chuàng)面愈合過程中重要細胞,調(diào)控著大量在創(chuàng)面愈合中復(fù)雜及必需的過程,如分泌多種生長因子及細胞素,分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)及創(chuàng)面組織重建。成纖維細胞在創(chuàng)面愈合過程中經(jīng)過遷移、分化、增殖,分泌大量纖維粘連蛋白(fibronectin, FN)及Ⅰ型膠原(collagen I, Col-1),與創(chuàng)面新生的毛細血管共同形成肉芽組織,填補組織缺陷,為表皮生長提供了條件。生長轉(zhuǎn)化因子-β1 (Transforming growth factor-β1, TGF-β1)在創(chuàng)面愈合中有著舉足輕重的地位,在創(chuàng)面愈合的早期,TGF-β1釋放增加,促使了各種炎癥細胞進入創(chuàng)面,在這個過渡階段,肉芽組織逐漸形成,TGF-β1促進了細胞外基質(zhì)的分泌,主要包括FN及Col-1。同時,TGF-β1可以促進成纖維細胞的遷移、分化、增殖,強烈趨化成纖維細胞,加速新生血管形成但抑制上皮細胞生長,刺激成纖維細胞合成ECM。TGF-β1可誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)化為以α-SMA為表型特征的肌成纖維細胞(Myofibroblast),后者在促進肉芽組織形成及創(chuàng)面收縮過程起重要作用。晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products, AGEs)與糖尿病足潰瘍的發(fā)生發(fā)展過程有著重要的關(guān)系,可抑制成纖維細胞遷移、轉(zhuǎn)化及合成纖維粘連蛋白及各類膠原的能力,在糖尿病患者體內(nèi)成纖維細胞細胞膜上RAGE持續(xù)高表達,可引起成纖維細胞損傷和功能損害。早期生長反應(yīng)因子-1 (Early growth response factor-1, Egr-1),屬于即刻早期基因(immediate early gene)家族成員之一,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)Egr-1在創(chuàng)面愈合過程發(fā)揮著重要的作用。在正常的皮膚成纖維細胞中,Egr-1的變化影響了超過600個基因的表達,涉及細胞分化、遷移、細胞外基質(zhì)的沉積、創(chuàng)面愈合、新生血管形成。此外,研究證實了Egr-1有促進新生血管形成及增加膠原纖維合成的作用,具有加速創(chuàng)面愈合的生物學(xué)效應(yīng)。Egr-1作為即刻早期基因家族中的一員,在創(chuàng)面愈合過程中起著重要調(diào)控作用。相關(guān)研究指出,TGF-β1可誘導(dǎo)皮膚成纖維細胞中Egr-1的表達,與此同時,也能誘導(dǎo)細胞外基質(zhì)(ECM)的分泌。但在糖尿病病理狀態(tài)下,TGF-β1誘導(dǎo)人源原代皮膚成纖維細胞中Egr-1是如何變化的,目前缺少相關(guān)研究。AGEs延緩了糖尿病足潰瘍的創(chuàng)面愈合,目前大多數(shù)集中于動物研究,缺少相關(guān)分子生物學(xué)證據(jù),糖尿病病理狀態(tài)下,成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)的功能是否受損,仍需要進一步證實。在皮膚成纖維細胞中,Egr-1是否作為關(guān)鍵基因,參與調(diào)控細胞外基質(zhì)的分泌,也需進一步證實。本研究以人源原代皮膚成纖維細胞為研究對象,探討TGF-β1在正常條件下及AGEs存在條件下誘導(dǎo)其表達Egr-1、FN及Co1-1的情況,再使用了針對Egr-1的siRNA及Egr-1過表達質(zhì)粒進行實驗初步推測Egr-1與細胞外基質(zhì)FN、Col-1之間的關(guān)系。最后,通過收集糖尿病足潰瘍創(chuàng)面組織及正常對照皮膚組織,檢測在Egr-1、FN、Col-1 mRNA及蛋白的表達是否存在差異。第一章TGF-β1在AGEs條件下誘導(dǎo)成纖維細胞表達Egr-1及細胞外基質(zhì)的特征目的探討TGF-β1在正常條件下及AGEs存在條件下誘導(dǎo)其表達Egr-1、FN及Col-1的情況,初步推測Egr-1與細胞外基質(zhì)FN、Col-1之間的關(guān)系。方法1.細胞培養(yǎng)：采用正常完全培養(yǎng)基(含25mmol/LD-葡萄糖,15%胎牛血清,1%青霉素鏈霉素混合液),于37℃、5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人源原代皮膚成纖維細胞,所有用于實驗研究的對象均為3-10代細胞。2.配制AGEs:取BSA溶液20ml,D-葡萄糖溶液6.36ml,青霉素溶液480μl,慶大霉素溶液204μl混合,0.22μm濾器過濾,置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育90天,4℃透析24h以去除未結(jié)合的葡萄糖。以相同方法制備未加入D-葡萄糖的的非糖化BSA作為對照。3.細胞分組：對照組(control)、TGF-β1組(TGF-β1:加入10ng/ml TGF-β1)、 TGF-β1聯(lián)合100ug/ml AGEs組(TGF-β1+A100:10ng/ml TGF-β1+100ug/ml AGEs)、TGF-β1聯(lián)合200ug/ml AGEs組(TGF-β1+A200:10ng/ml TGF-β1+200ug/ml AGEs)、TGF-β1聯(lián)合300ug/ml AGEs組(TGF-β1+A300: 10ng/ml TGF-β1+300ug/ml AGEs)、檢測Egr-1時按時間點分組(Omin,15min, 30min,60min,120min 及 360min:加入10ng/ml TGF-β1后刺激的時間)、300ug/ml AGEs組檢測Egr-1( AGEs:300ug/ml AGEs刺激適當(dāng)時間)、TGF-β1聯(lián)合300ug/ml AGEs 組檢測 Egr-1 (TGF-β1+AGEs:10ng/ml TGF-β1+300ug/ml AGEs刺激適當(dāng)時間)。4.使用正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細胞后,加入10ng/ml濃度的TGF-β1刺激24小時后,提取總蛋白及總RNA,使用實時熒光定量PCR及免疫印跡試驗,檢測α-SMA mRNA及蛋白表達情況。5.使用正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細胞后,加入TGF-β1 (10ng/ml)刺激后,同時使用不同濃度的AGEs (100、200、300ug/ml),培養(yǎng)24小時,提取總RNA及總蛋白,使用實時熒光定量PCR及免疫印跡試驗,檢測FN及Col-1 mRNA及蛋白表達情況。6.使用正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細胞后,加入TGF-β1 (10ng/ml)刺激,在0min,15min,30min,60min,120min及360min分別收集細胞,提取總RNA及總蛋白,檢測Egr-1 mRNA及蛋白表達情況。7.使用正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)成纖維細胞后,在加入TGF-β1 (10ng/ml)刺激時,同時加入300ug/ml的AGEs,適當(dāng)時間后收集細胞提取總RNA及總蛋白,檢測Egr-1 mRNA及蛋白表達情況。8.統(tǒng)計學(xué)分析：實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,各組計量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)的比較采用單向方差分析(One-way ANOVA),組間多重比較均使用LSD法；如果組間方差不齊,組間多重比較均使用Dunnett's T3法。所得P值小于0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.TGF-β1對皮膚成纖維細胞α-SMA mRNA及蛋白表達的影響：TGF-β1刺激24小時后,qRT-PCR檢測α-SMA mRNA表達較對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),Western blot檢測蛋白表達顯示同樣結(jié)果,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.在不同濃度的AGEs影響下,TGF-β1對皮膚成纖維細胞FN及Col-1 mRNA及蛋白表達的影響：TGF-β1刺激24小時后,FN及Col-1 mRNA及蛋白表達量較對照組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),但在加入不同濃度的AGEs后,FN及Co1-1表達較TGF-β1刺激組呈下降趨勢,尤其以300ug/ml濃度明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。故后續(xù)實驗使用AGEs作用濃度為300ug/ml。3.TGF-β1誘導(dǎo)皮膚成纖維細胞Egr-1 mRNA及蛋白表達的特點：加入β1TGF-后,隨著時間延長,15min Egr-1 mRNA表達開始升高,30min時升至最高,約為空白組的15倍差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。隨后開始逐漸下降,360min時降至與空白對照組同一水平。后續(xù)實驗需要檢測Egr-1 mRNA表達水平,選用加入TGF-β1后30min作為實驗時間點。加入TGF-β1后,Egr-1蛋白表達水平隨著時間延長逐漸升高,在120min時表達水平是對照組的1.6倍左右,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),隨后表達開始下降。后續(xù)實驗需要檢測Egr-1蛋白表達水平,選用加入TGF-β1后120min作為實驗時間點。4.在300ug/ml的AGEs作用下,TGF-β1誘導(dǎo)皮膚成纖維細胞Egr-1 mRNA及蛋白表達的特點：加入TGF-β1刺激30min后,Egr-1 mRNA表達較對照組明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。AGEs組較對照組無明顯變化,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。加入TGF-β1刺激時同時加入300ug/ml的AGEs,Egr-1 mRNA的表達明顯低于TGF-β1刺激組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示：加入TGF-β1刺激120min后,Egr-1蛋白表達水平較對照組升高約1.8倍,單加AGEs刺激組較對照組無明顯差異,加入TGF-β1刺激時同時加入300ug/ml的AGEs, Egr-1蛋白表達量較TGF-β1刺激組明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.TGF-β1誘導(dǎo)了以α-SMA為標(biāo)志物的成纖維細胞表型轉(zhuǎn)換,此表型轉(zhuǎn)換過程在創(chuàng)面愈合過程中起著關(guān)鍵作用。2.在AGEs影響下,TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)能力受損。3.通過qPCR及Western blot檢測方法,得出了人源皮膚原代成纖維細胞Egr-1的表達特點,加入TGF-β1刺激后30mmin為mRNA表達最高的時間點,120min為蛋白表達最高的時間點。4.300ug/ml的AGEs與TGF-β1共同作用于成纖維細胞,Egr-1 mRNA及蛋白的表達明顯低于TGF-β1刺激組,首次闡述了在成纖維細胞中,Egr-1在AGEs影響下的表達特點。5.Egr-1在TGF-β1刺激及TGF-β1聯(lián)合AGEs刺激下,與細胞外基質(zhì)FN、Co1-1的表達呈現(xiàn)一致性。第二章TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細胞表達的Egr-1與細胞外基質(zhì)之間的關(guān)系目的明確Egr-1與FN、Col-1之間的聯(lián)系,初步探討其中的上下游關(guān)系。方法1.細胞培養(yǎng)：同第一章。2.實驗分組：空白組(blank)、脂質(zhì)體組(mock)、陰性對照組(Negative control, NC)、陰性對照聯(lián)合TGF-β1組(NC+TGF-β1)、Egr-1-homo-1624聯(lián)合TGF-β1組(si1624+TGF-β1)、Egr-1-homo-749聯(lián)合TGF-β1組(si749+TGF-β1)、 Egr-1-homo-1508聯(lián)合TGF-β1組(si1508+TGF-β1)、Egr-1-homo-353聯(lián)合TGF-β組(si3531TGF-β1)、空載體組(pENTER)、過表達組(pENTER-Egr-1)、空載體聯(lián)合TGF-β1組(pENTER+TGF-β1)、過表達聯(lián)合TGF-β1組(pENTER-Egr-1+ TGF-β1).3.分別轉(zhuǎn)染NC, si1624, si749, si1508, si353后,加入10ng/ml TGF-β1刺激30分鐘后,收集細胞,提取總RNA進行qPCR檢測Egr-1。轉(zhuǎn)染NC, si1624,si749后,加入10ng/ml TGF-β1刺激120分鐘后,收集細胞,提取總蛋白進行Western blot檢測Egr-1表達水平。4.成纖維細胞經(jīng)si1624, si749轉(zhuǎn)染后,加入10ng/ml TGF-β1刺激24小時,收集細胞,提取總RNA及總蛋白進行檢測FN及Co1-1。5.進行質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染,提取總RNA及總蛋白觀察Egr-1的表達變化。6.使用10ng/ml TGF-β1刺激經(jīng)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的成纖維細胞24小時,收集細胞提取總RNA及總蛋白檢測FN及Co1-1。7.統(tǒng)計學(xué)分析：同第一章。結(jié)果1.TGF-β1誘導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞Egr-1 mRNA及蛋白的表達特點：blank、mock組與NC組之間無明顯差異,NC組加入10ng/ml TGF-β1刺激后,Egr-1 mRNA及蛋白表達明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染了si1624, si749的細胞,加入lOng/ml TGF-β1刺激后,Egr-1 mRNA及蛋白表達均低于NC+TGF-β1組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.TGF-β1誘導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞FN、Col-1 mRNA及蛋白的表達特點：blan、mock、NC三組間FN、Col-1 mRNA及蛋白表達未見明顯差異,加入10ng/ml TGF-β1刺激24小時后,FN、Col-1 mRNA及蛋白表達量較NC組明顯上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)si 1624, si749轉(zhuǎn)染后的兩個組別的細胞,加入10ng/ml TGF-β1刺激后,mRNA及蛋白表達量較對照組并無明顯變化,但明顯低于NC+TGF-β1表達量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞Egr-1 mRNA及蛋白的表達特點：通過空載體及過表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染24小時后,過表達組Egr-1 mRNA及蛋白的表達均較空載體組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.TGF-β1誘導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的成纖維細胞FN、Col-1 mRNA及蛋白的表達特點：經(jīng)pENTER-Egr-1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組FN、Col-1 mRNA及蛋白的表達量均較空載組明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同時,空載組加入10ng/ml TGF-β1刺激后,FN及Col-1 mRNA及蛋白的表達量與過表達組相似,同樣明顯高于空載組(P0.05)。過表達組中加入10ng/ml TGF-β1刺激后,FN、Col-1 mRNA及蛋白表達高于空載組(P0.05)。結(jié)論在皮膚成纖維細胞中,TGF-β1通過Egr-1,進而促進了細胞外基質(zhì)FN、Col-1的表達。Egr-1在成纖維細胞分泌細胞外基質(zhì)的過程中起重要的上游調(diào)節(jié)作用。第三章Egr-1、FN及Col-1在糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面組織中的表達特點目的初步探討Egr-1、FN、Col-1在糖尿病足潰瘍創(chuàng)面組織與正常對照間的表達差異。方法1.收取南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科2014年2月至2014年3月住院的糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)緣組織(7例)及正常健康對照皮膚組織(5例),通過qPCR及Western blot檢測Egr-1、FN及Co1-1的表達水平。2.統(tǒng)計學(xué)分析：非正態(tài)分布資料采用中位數(shù)(范圍)描述,余同第一章。結(jié)果正常對照組中,Egr-1、FN、Col-1 mRNA及蛋白的表達均明顯高于糖尿病足潰瘍組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論首次報道了糖尿病足潰瘍組織Egr-1、FN、Col-1的表達均明顯低于正常對照組。Egr-1與細胞外基質(zhì)的變化呈一致性。
【關(guān)鍵詞】：糖尿病足潰瘍 早期生長反應(yīng)因子-1 晚期糖基化終末產(chǎn)物 皮膚成纖維細胞 細胞外基質(zhì)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-21
• 前言21-28
• 第一章 TGF-β1在AGEs條件下誘導(dǎo)成纖維細胞表達Egr-1及細胞外基質(zhì)的特征28-58
• 第一節(jié) 實驗材料28-36
• 第二節(jié) 實驗方法與步驟36-46
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果46-55
• 第四節(jié) 討論55-58
• 第二章 TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細胞表達的Egr-1與細胞外基質(zhì)之間的關(guān)系58-74
• 第一節(jié) 實驗材料58-60
• 第二節(jié) 實驗方法與步驟60-62
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果62-72
• 第四節(jié) 討論72-74
• 第三章 Egr-1、FN及Col-1在糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面組織中的表達特點74-80
• 第一節(jié) 實驗對象74-75
• 第二節(jié) 材料與方法75-76
• 第三節(jié) 實驗結(jié)果76-78
• 第四節(jié) 討論78-80
• 全文小結(jié)80-81
• 參考文獻81-85
• 附錄85-87
• 攻讀學(xué)位期間成果87-88
• 致謝88-89

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李欣蔚;張勇;;整聯(lián)蛋白及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控[J];動物營養(yǎng)學(xué)報;2012年07期

  本文關(guān)鍵詞：晚期糖基化終末產(chǎn)物處理的成纖維細胞中TGF-β1通過Egr-1調(diào)控細胞外基質(zhì)生成，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：455586