本文關鍵詞：腸道菌群及腸道炎癥在OLETF大鼠糖尿病發(fā)病中的動態(tài)變化，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:近些年越來越多的研究顯示,2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展與腸道細菌的變化密切相關,腸道菌群結構的改變通過誘導腸壁炎癥反應,損傷腸粘膜屏障完整性,進而造成體內慢性炎癥反應,參與胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的整個過程。本研究通過分析自發(fā)性2型糖尿病大鼠——OLETF大鼠從正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量下降階段至糖尿病階段的整個發(fā)病過程中腸道菌群結構、腸道及血清細菌脂多糖水平、腸道炎癥反應、腸道組織病理以及腸粘膜滲漏性的動態(tài)變化,以探討腸道菌群紊亂在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中的作用及潛在機制。方法:選取自發(fā)2型糖尿病大鼠OLETF大鼠作為模型組大鼠,觀察其病程進展的不同階段(正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量下降階段、糖尿病階段),同時選取與OLETF大鼠相同遺傳背景的LETO大鼠作為正常對照組大鼠,對各組及不同病程階段的大鼠留取血標本及糞便標本,同時處死對應時期的相應數(shù)量的大鼠取腸道組織標本。生化法檢測大鼠基本生化指標;運用16S r DNA焦磷酸測序技術進行腸道菌群基因測序,以鑒別菌群的多樣性以及在不同分類水平上的豐度;ELISA法檢測血清及糞便脂多糖(LPS)水平,同時運用該方法檢測血清中的腸道滲漏指標連蛋白(zonulin)、二胺氧化酶(DAO);通過光鏡對腸粘膜上皮絨毛、完整性等病理改變進行觀察,通過透射電鏡對腸粘膜上皮緊密連接、中間連接及橋粒連接等細微結構的改變進行觀察;運用Western blot技術對腸道組織局部炎癥指標TLR4及NFκb進行檢測;分析以上各個指標在正常對照組(NC組)、OLETF大鼠正常血糖階段(NGT組)、正常血糖-高胰島素血癥階段(HI組)、糖耐量減低階段(IGT組)及糖尿病階段(DM組)的動態(tài)變化。結果:(1)LETO大鼠(也即正常對照組大鼠)與OLETF大鼠基線資料(也即OLETF大鼠正常血糖階段)相比,細菌門類構成上差異不明顯,但在排名前十位的細菌種屬中,OLETF大鼠正常血糖階段的乳酸菌屬及Phascholarctobacterium菌屬的相對豐度較LETO大鼠明顯偏低(P0.05);而血清及糞便LPS水平兩組無明顯差異;腸組織局部炎癥標志物TLR4和NFκB的表達量兩組間無明顯差異;血清中的腸道滲漏標志物zonulin和DAO兩組間也無明顯差異。(2)OLETF大鼠在正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量減低階段、糖尿病階段的腸道微生物豐富度及物種總數(shù)具有明顯差異,正常血糖-高胰島素血癥階段開始,較正常血糖階段腸道微生物的物種總數(shù)就明顯下降,而在正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量降低階段及糖尿病階段的動態(tài)發(fā)病過程中,腸道微生物的物種總數(shù)逐漸升高。說明在OLETF大鼠糖尿病發(fā)生之前,腸道菌群的結構就已經發(fā)生變化,并且在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程中,腸道菌群結構的變化參與其中;(3)腸道菌群在門水平上的檢測結果顯示,OLETF大鼠在正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量降低階段及糖尿病階段,各組的菌群豐度排名前三位的細菌門類均為:硬壁菌門,擬桿菌門,變形菌門,但是各組間這三個主要門類的細菌豐度的比例差異較大;(4)我們以擬桿菌門與變形菌門的總和與硬壁菌門的比值作為評價革蘭氏染色陰性細菌與革蘭氏染色陽性細菌的比值,結果現(xiàn)實:OLETF大鼠正常血糖階段腸道革蘭氏染色陰性的細菌與革蘭氏染色陽性細菌的比例為1.10,而正常血糖-高胰島素血癥階段為2.27、糖耐量降低階段為1.18,糖尿病階段為2.00,均表現(xiàn)為革蘭氏染色陰性細菌的比例增加,而革蘭氏染色陽性細菌比例減少。(5)血清及糞便脂多糖(LPS)水平在OLETF大鼠正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量降低階段、糖尿病階段呈升高趨勢,且血清及糞便LPS水平在OLETF大鼠糖尿病階段較正常血糖階段明顯升高(P0.05)。(6)腸道組織TLR4及NFκB的表達量在OLETF大鼠正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量減低階段、糖尿病階段呈升高趨勢,正常血糖-高胰島素血癥階段及糖耐量減低階段較正常血糖階段均明顯升高(P0.05),糖尿病階段較正常血糖階段、高胰島素血癥階段及糖耐量減低階段均明顯升高(P0.05)。(7)病理觀察顯示,與OLETF大鼠正常血糖階段相比,從正常血糖-高胰島素血階段開始,小腸上皮的完整性開始降低,緊密連接及中間連接開始損傷,至糖尿病階段腸粘膜完整性變化更加明顯。(8)血清zonulin在OLETF大鼠正常血糖階段、正常血糖-高胰島素血癥階段、糖耐量減低階段、糖尿病階段呈逐漸升高的趨勢,且糖尿病階段較正常血糖階段升高較明顯(P0.05);而血清DAO水平在四組間也呈升高趨勢,且正常血糖-高胰島素血癥階段及糖尿病階段與正常血糖階段相比升高均比較明顯(P0.05)。結論:(1)LETO大鼠與OLETF大鼠基線狀態(tài)下的腸道菌群結構有差異,可能與兩種大鼠遺傳背景存在差異有關,因此腸道菌群紊亂可能參與OLETF大鼠自然發(fā)病的過程。(2)在OLETF大鼠2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中,腸道菌群存在動態(tài)變化過程。在正常血糖-高胰島素血癥階段就已存在革蘭氏染色陰性細菌的比例明顯增加,腸道菌群的紊亂可能通過誘導腸道炎癥反應及腸屏障受損而促進內毒素血癥,加重胰島素抵抗,從而參與了2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展。
【關鍵詞】：糖尿病 腸道菌群 腸粘膜炎癥 腸壁滲漏性 內毒素血癥
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-13
• 前言13-17
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-17
• 對象和材料17-20
• 1.1 研究對象17
• 1.2 主要試劑17-18
• 1.3 主要儀器18-20
• 實驗方法20-34
• 2.1 動物實驗20-21
• 2.2 腸道菌群檢測21-25
• 2.3 ELISA法檢測血清及糞便脂多糖25-27
• 2.4 western blot法檢測腸道組織TLR4及NFκB27-32
• 2.5 ELISA法檢測血清腸道粘膜滲漏標志物zonulin及DAO32
• 2.6 腸道病理學檢查32-34
• 結果34-69
• 3.1 LETO大鼠與OLETF大鼠基線資料比較34-44
• 3.1.1 一般生化指標及糖代謝指標34-37
• 3.1.2 腸道菌群門類及種屬比較37-41
• 3.1.3 血清及糞便脂多糖水平41-42
• 3.1.4 腸道局部炎癥反應42-43
• 3.1.5 腸粘膜滲漏標志物水平43-44
• 3.2 OLETF大鼠不同病程階段相關資料的動態(tài)變化44-69
• 3.2.1 一般生化指標及糖代謝指標44-48
• 3.2.2 腸道菌群結果48-62
• 3.2.2.1 腸道基因組的提取及檢測48-49
• 3.2.2.2 OTU聚類49-50
• 3.2.2.3 α 多樣性分析50-53
• 3.2.2.4 β 多樣性分析53-55
• 3.2.2.5 不同分類水平上的菌群差異比較55-62
• 3.2.3 腸道及血清脂多糖水平62-63
• 3.2.4 腸道局部TLR4及NFκb表達水平63-64
• 3.2.5 腸道病理結果64-67
• 3.2.5.1 腸組織HE染色結果64-65
• 3.2.5.2 腸組織電鏡結果65-67
• 3.2.6 腸粘膜滲漏標志物zonulin、DAO水平67-69
• 討論69-79
• 4.1 16srDNA測序技術的應用69-70
• 4.2 LETO大鼠與OLETF大鼠基線資料差異70-71
• 4.3 腸道菌群及腸道炎癥在OLETF大鼠糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中的作用71-78
• 4.3.1 腸道菌群變化71-75
• 4.3.2 腸道炎癥及腸道滲漏性變化75-77
• 4.3.3 代謝性內毒素血癥77-78
• 總結78-79
• 結論79-80
• 參考文獻80-85
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明85-86
• 綜述 腸道微生物、腸道炎癥在2型糖尿病中的作用86-100
• 綜述參考文獻95-100
• 致謝100

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  本文關鍵詞：腸道菌群及腸道炎癥在OLETF大鼠糖尿病發(fā)病中的動態(tài)變化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：406911