目的:克隆粉塵螨Ⅴ類變應(yīng)原Der f5基因并進(jìn)行蛋白表達(dá),分析其對(duì)哮喘小鼠特異性免疫治療效果。方法:(1)已知der f5基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)引物,提取粉塵螨總RNA,擴(kuò)增der f5基因片段,RT-PCR法擴(kuò)增后產(chǎn)物與克隆載體p UC57連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5α中,經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定獲得p UC57-Der f5陽(yáng)性菌株。提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,連接到原核表達(dá)載體p ET-28a(+)產(chǎn)生重組原核表達(dá)載體p ET28a(+)-Der f5,并用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。(2)將重組表達(dá)載體p ET28a(+)-Der f5轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)菌株中。用IPTG小劑量誘導(dǎo)表達(dá)der f5蛋白,優(yōu)化條件進(jìn)行大規(guī)模表達(dá)和純化;(3)構(gòu)建變應(yīng)原der f5致敏的小鼠哮喘模型,用純化的變應(yīng)原der f5為疫苗對(duì)小鼠哮喘模型進(jìn)行特異性免疫治療。最后1次霧化吸入24 h后,收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)、分離血清,同時(shí)進(jìn)行脾細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)BALF中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)數(shù)目計(jì)數(shù);ELISA法分別檢測(cè)BALF中和脾細(xì)胞培養(yǎng)...

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 粉塵螨第Ⅴ類變應(yīng)原Der f5基因的克隆、原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建與表達(dá)
    研究?jī)?nèi)容
    材料與方法
        1 材料
            1.1 質(zhì)粒
            1.2 菌株
            1.3 引物
            1.4 粉塵螨
            1.5 主要試劑
            1.6 主要儀器和設(shè)備
            1.7 主要試劑配制
        2 方法
            2.1 粉塵螨總RNA的提取
            2.2 Der f5基因的克隆與鑒定
            2.3 p ET28a(+)-Der f 5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.4 Der f5蛋白的小劑量誘導(dǎo)表達(dá)
            2.5 Der f5蛋白的大劑量誘導(dǎo)表達(dá)
            2.6 Der f5蛋白的純化及鑒定
            2.7 純化產(chǎn)物的Western blot分析
            2.8 Der f 5 蛋白濃度的測(cè)定
    結(jié)果
        1 目的基因Der f5的c DNA片段RT-PCR擴(kuò)增
        2 重組克隆載體p UC57-Der f5的構(gòu)建及酶切鑒定
        3 重組表達(dá)質(zhì)粒p ET28a(+)-Der f 5 的鑒定
        4 Der f5蛋白的SDS-PAGE分析
        5 Der f5重組蛋白的純化
        6 純化產(chǎn)物的免疫印記（Western blot）鑒定
        7 Der f5蛋白濃度測(cè)定
    討論
第二部分Der f5重組蛋白對(duì)哮喘小鼠免疫治療的效果分析
    研究?jī)?nèi)容
    材料與方法
        1 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要試劑的配制
        2 方法
            2.1 實(shí)驗(yàn)分組
            2.2 哮喘小鼠模型的建立
            2.3 特異性免疫治療
            2.4 血清抗原特異性Ig E和Ig G1和Ig G2a抗體含量測(cè)定
            2.5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞和白細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)
            2.6 BALF中特異性細(xì)胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的檢測(cè)
            2.7 ELISA法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-5、IL-17和IFN-γ 因子含量
            2.8 肺組織病理切片觀察
            2.9 數(shù)據(jù)分析
    結(jié)果
        1 各組小鼠癥狀和體征的改變
        2 檢測(cè)小鼠血清中抗原特異性Ig E、Ig G1和Ig G2a抗體表達(dá)的含量
        3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的含量
        4 脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液（SCSS）中細(xì)胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的含量
        5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目計(jì)數(shù)
        6 肺組織切片HE染色
    討論
結(jié)論
論文創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介及讀研期間主要科研成果
致謝



本文編號(hào)：3768606