目的:克隆粉塵螨Ⅴ類變應原Der f5基因并進行蛋白表達,分析其對哮喘小鼠特異性免疫治療效果。方法:(1)已知der f5基因序列設計相應引物,提取粉塵螨總RNA,擴增der f5基因片段,RT-PCR法擴增后產(chǎn)物與克隆載體p UC57連接,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH-5α中,經(jīng)酶切及測序鑒定獲得p UC57-Der f5陽性菌株。提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,連接到原核表達載體p ET-28a(+)產(chǎn)生重組原核表達載體p ET28a(+)-Der f5,并用限制性內(nèi)切酶進行酶切和測序驗證。(2)將重組表達載體p ET28a(+)-Der f5轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21(DE3)菌株中。用IPTG小劑量誘導表達der f5蛋白,優(yōu)化條件進行大規(guī)模表達和純化;(3)構(gòu)建變應原der f5致敏的小鼠哮喘模型,用純化的變應原der f5為疫苗對小鼠哮喘模型進行特異性免疫治療。最后1次霧化吸入24 h后,收集小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)、分離血清,同時進行脾細胞培養(yǎng)。對BALF中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞(EOS)數(shù)目計數(shù);ELISA法分別檢測BALF中和脾細胞培養(yǎng)...

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 粉塵螨第Ⅴ類變應原Der f5基因的克隆、原核表達重組載體的構(gòu)建與表達
    研究內(nèi)容
    材料與方法
        1 材料
            1.1 質(zhì)粒
            1.2 菌株
            1.3 引物
            1.4 粉塵螨
            1.5 主要試劑
            1.6 主要儀器和設備
            1.7 主要試劑配制
        2 方法
            2.1 粉塵螨總RNA的提取
            2.2 Der f5基因的克隆與鑒定
            2.3 p ET28a(+)-Der f 5 重組表達載體的構(gòu)建
            2.4 Der f5蛋白的小劑量誘導表達
            2.5 Der f5蛋白的大劑量誘導表達
            2.6 Der f5蛋白的純化及鑒定
            2.7 純化產(chǎn)物的Western blot分析
            2.8 Der f 5 蛋白濃度的測定
    結(jié)果
        1 目的基因Der f5的c DNA片段RT-PCR擴增
        2 重組克隆載體p UC57-Der f5的構(gòu)建及酶切鑒定
        3 重組表達質(zhì)粒p ET28a(+)-Der f 5 的鑒定
        4 Der f5蛋白的SDS-PAGE分析
        5 Der f5重組蛋白的純化
        6 純化產(chǎn)物的免疫印記（Western blot）鑒定
        7 Der f5蛋白濃度測定
    討論
第二部分Der f5重組蛋白對哮喘小鼠免疫治療的效果分析
    研究內(nèi)容
    材料與方法
        1 材料
            1.1 實驗動物
            1.2 主要試劑
            1.3 主要試劑的配制
        2 方法
            2.1 實驗分組
            2.2 哮喘小鼠模型的建立
            2.3 特異性免疫治療
            2.4 血清抗原特異性Ig E和Ig G1和Ig G2a抗體含量測定
            2.5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細胞和白細胞總數(shù)計數(shù)
            2.6 BALF中特異性細胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的檢測
            2.7 ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中IL-5、IL-17和IFN-γ 因子含量
            2.8 肺組織病理切片觀察
            2.9 數(shù)據(jù)分析
    結(jié)果
        1 各組小鼠癥狀和體征的改變
        2 檢測小鼠血清中抗原特異性Ig E、Ig G1和Ig G2a抗體表達的含量
        3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的含量
        4 脾細胞培養(yǎng)上清液（SCSS）中細胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的含量
        5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中白細胞總數(shù)和嗜酸性粒細胞數(shù)目計數(shù)
        6 肺組織切片HE染色
    討論
結(jié)論
論文創(chuàng)新點
參考文獻
綜述
    參考文獻
作者簡介及讀研期間主要科研成果
致謝



本文編號：3768606