目的:百草枯(PQ)是一種高效、廉價的除草劑,與土壤接觸后可迅速失活,植物體內(nèi)很少殘留,如能正常使用,則安全性高,且環(huán)境污染少,有利于可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。然而,因偶然攝入或蓄意自殺所致的PQ中毒事件,在臨床上卻屢見不鮮,在世界范圍內(nèi)口服農(nóng)藥自殺事件中也非常常見,且致死率很高,嚴(yán)重中毒后存活率不足50%。由于其中毒機制迄今不明,沒有特效解毒劑,其中毒后給人們帶來的危害不可忽視。PQ中毒可導(dǎo)致多種器官功能障礙,且以肺損傷最為嚴(yán)重,中毒早期以急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征為主要表現(xiàn),也是中毒早期主要的死亡原因。目前研究認(rèn)為,氧化損傷及免疫炎癥反應(yīng)在PQ中毒發(fā)病過程中的作用不可估量,但具體分子機制不明。PQ中毒可以引起細胞DNA損傷。正常情況下,在真核細胞中,只有細胞核和線粒體中存在DNA,它是遺傳信息的載體,對維持機體生命活動至關(guān)重要。當(dāng)組織細胞損傷時導(dǎo)致遺傳物質(zhì)外漏,易位的self-DNA異常增多,可以作為損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)而存在,是誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)的重要原因,也是導(dǎo)致肺部炎癥損傷的重要因素。線粒體DNA(mtDNA)是self-DNA的重要成員之一,其在PQ中毒發(fā)病機制中的重要...

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分 :STING-IRF3信號通路介導(dǎo)百草枯中毒急性肺損傷
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 材料
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 實驗動物
        2.3 動物模型建立及分組
        2.4 HE染色及肺損傷病理評分
            2.4.1 HE染色
            2.4.2 肺損傷病理評分
        2.5 肺臟濕重/干重(W/D)比值
        2.6 小鼠肺組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)測定
            2.6.1 MDA檢測(硫代巴比妥酸反應(yīng)法)
            2.6.2 SOD檢測(黃嘌呤氧化酶法)
        2.7 細胞培養(yǎng)
        2.8 細胞活性檢測
        2.9 細胞轉(zhuǎn)染
        2.10 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)
            2.10.1 RNA提取
            2.10.2 cDNA合成
            2.10.3 Real-time PCR
        2.11 免疫印跡實驗(Western blot實驗)
            2.11.1 樣本蛋白的提取
            2.11.2 蛋白濃度測定(BCA法)
            2.11.3 SDS-PAGE凝膠制備
            2.11.4 電泳
            2.11.5 轉(zhuǎn)膜
            2.11.6 抗原抗體反應(yīng)
            2.11.7 化學(xué)發(fā)光及結(jié)果分析
        2.12 免疫組化實驗
            2.12.1 石蠟切片的制作
            2.12.2 抗原修復(fù)
            2.12.3 抗原抗體反應(yīng)
            2.12.4 顯色反應(yīng)
            2.12.5 封片及圖像采集
        2.13 免疫熒光染色
            2.13.1 細胞固定
            2.13.2 細胞膜通透及抗原封閉
            2.13.3 抗原抗體反應(yīng)
            2.13.4 DAPI染色
            2.13.5 封片及圖像采集
        2.14 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
            2.14.1 標(biāo)本采集
            2.14.2 ELISA
        2.15 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 小鼠肺組織病理變化及W/D比值
        3.2 小鼠肺組織MDA及SOD的表達變化
        3.3 小鼠肺組織中Sting、Irf3和IfnβmRNA表達水平的變化
        3.4 小鼠肺組織中STING及 IRF3的表達分布情況
        3.5 小鼠肺組織中STING和 IRF3(p IRF3)蛋白表達水平的變化
        3.6 小鼠血清中IFNβ表達水平的變化
        3.7 RAW264.7小鼠巨噬細胞的活性
        3.8 RAW264.7小鼠巨噬細胞中STING和 IRF3的表達分布
        3.9 STING在PQ誘導(dǎo)IFNβ表達過程中的作用
        3.10 IRF3在PQ誘導(dǎo)IFNβ表達過程中的作用
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分 :TBK1參與調(diào)節(jié)STING-IRF3通路介導(dǎo)的百草枯中毒小鼠急性肺損傷
    1 前言
    2 實驗材料及方法
        2.1 材料及主要儀器設(shè)備
        2.2 實驗動物
        2.3 動物分組
        2.4 HE染色及肺損傷病理評分
        2.5 肺泡灌洗液蛋白濃度測定
        2.6 細胞培養(yǎng)
        2.7 細胞模型的藥物處理濃度篩選及細胞分組
            2.7.1 細胞模型的藥物處理濃度篩選
            2.7.2 細胞分組
        2.8 肺組織及RAW264.7細胞中的活性氧(ROS)水平檢測
            2.8.1 肺組織ROS水平檢測
            2.8.2 RAW264.7細胞中ROS水平檢測
        2.9 免疫組化實驗
            2.9.1 組織免疫組化實驗
            2.9.2 細胞免疫組化實驗
        2.10 Western blot實驗
            2.10.1 細胞核蛋白及細胞漿蛋白分離
            2.10.2 BCA法測蛋白濃度并標(biāo)準(zhǔn)化
            2.10.3 Western blot實驗
        2.11 RT-q PCR實驗
        2.12 ELISA實驗
        2.13 統(tǒng)計方法
    3 實驗結(jié)果
        3.1 肺組織病理改變及肺泡灌洗液蛋白濃度
        3.2 藥物處理RAW264.7細胞的濃度篩選
        3.3 肺組織ROS及炎性因子表達水平的變化
        3.4 RAW264.7細胞ROS及炎性因子表達水平的變化
        3.5 肺組織中NF-κBp65和IRF3的表達分布
        3.6 RAW264.7細胞中NF-κBp65和IRF3的表達分布
        3.7 肺組織及RAW264.7細胞的胞漿蛋白中TBK1、pTBK1的表達
        3.8 肺組織及RAW264.7細胞的胞漿蛋白內(nèi)STING的表達變化
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分 :熊果酸通過抑制cGAS-STING通路緩解百草枯中毒小鼠急性肺損傷
    1 前言
    2 實驗材料及方法
        2.1 實驗試劑
        2.2 實驗動物
        2.3 動物分組
        2.4 HE染色及肺損傷病理評分
        2.5 肺臟濕重/干重(W/D)比值
        2.6 細胞培養(yǎng)
        2.7 CCK8實驗及細胞分組
            2.7.1 CCK8實驗
            2.7.2 細胞分組
        2.8 DHE染色
            2.8.1 組織DHE染色
            2.8.2 細胞DHE染色
        2.9 Real-time PCR實驗檢測mtDNA與nDNA
            2.9.1 樣本采集
            2.9.2 樣本DNA的提取
            2.9.3 Real time-PCR實驗
        2.10 雙鏈DNA(dsDNA)的檢測
            2.10.1 樣本采集
            2.10.2 dsDNA的檢測
        2.11 Western blot實驗
        2.12 ELISA實驗
        2.13 統(tǒng)計方法
    3 實驗結(jié)果
        3.1 小鼠體重變化、肺組織病理改變和肺臟W/D比值
        3.2 藥物處理RAW264.7細胞的濃度篩選
        3.3 小鼠肺組織和RAW264.7細胞的氧化損傷情況
        3.4 小鼠肺泡灌洗液、血清及細胞培養(yǎng)上清液中dsDNA的表達
        3.5 小鼠肺組織及RAW264.7細胞中c GAS的表達變化
        3.6 小鼠肺組織及RAW264.7細胞中STING、TBK1(pTBK1)、IRF3(pIRF3)的表達變化
        3.7 小鼠肺泡灌洗液、血清及細胞培養(yǎng)上清液中IFNβ的表達變化
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡介



本文編號：3743043