本文關(guān)鍵詞：淀粉樣前體蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞的表達(dá)及與卵巢衰老的相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢衰老尤其是早發(fā)型卵巢衰老(Premature Ovarian Aging, POA)伴隨著卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱,卵母細(xì)胞質(zhì)量下降是導(dǎo)致女性不孕的主要原因之一極大威脅著女性的生殖健康。既往對(duì)卵巢衰老的研究主要集中于尋找出可以預(yù)測(cè)、評(píng)判卵巢功能的指標(biāo),然而關(guān)于卵巢功能下降的確切機(jī)制研究甚少。普遍認(rèn)為年齡是影響卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老的發(fā)生存在著極大的個(gè)體差異性,提示我們卵巢的內(nèi)部因素比年齡更能決定生育儲(chǔ)備功能。卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育異常、顆粒細(xì)胞的凋亡加速導(dǎo)致卵泡閉鎖是卵巢儲(chǔ)備功能下降的根本原因。研究參與調(diào)節(jié)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育、閉鎖過(guò)程的基因?qū)τ诮沂韭殉矁?chǔ)備功能下降的機(jī)制有著重要意義。有關(guān)阿爾茨海默病(Alzheimer Disease,AD)的研究發(fā)現(xiàn)AD模型中的轉(zhuǎn)基因小鼠均出現(xiàn)不育,在AD中發(fā)揮關(guān)鍵性作用的淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)及其代謝產(chǎn)物的水平升高。APP蛋白屬I型膜整合糖蛋白,經(jīng)β和γ分泌酶連續(xù)裂解的過(guò)程中,APP被p分泌酶(p-site APP cleaving enzyme1, BACE1)水解產(chǎn)生一種APP羧基末端片段(C-terminal fragment,CTF)---C99。C99包含一個(gè)完整的β樣淀粉蛋白(Amyloid β peptide,Aβ)序列,隨后在跨膜區(qū)內(nèi)被γ分泌酶裂解生成具有神經(jīng)毒性的Ap。BACE1幾乎在人體所有的組織器官中均有表達(dá),它是在APP的淀粉樣分解途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分泌酶,也是Aβ產(chǎn)生過(guò)程中的限速酶。Ap的產(chǎn)生、聚集和沉積被認(rèn)為是AD發(fā)病機(jī)制的首要和中心環(huán)節(jié)。已證實(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠中APP的高表達(dá)及其代謝產(chǎn)物Aβ的增加使細(xì)胞更易受到氧化應(yīng)激的損傷、降低細(xì)胞的抗凋亡能力并導(dǎo)致細(xì)胞死亡,提示APP及其代謝產(chǎn)物可能通過(guò)增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑對(duì)卵巢內(nèi)卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和凋亡以及卵巢功能產(chǎn)生影響,而關(guān)于APP蛋白在卵巢衰老中作用的研究尚屬空白。本研究擬采用分子生物學(xué)方法,從蛋白和基因水平探索APP蛋白、APP淀粉樣裂解途徑關(guān)鍵酶(BACE1)及凋亡調(diào)控基因Bcl-2家族成員在卵巢衰老患者的顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況,APP代謝產(chǎn)物Aβ42在卵泡液中的表達(dá)水平,分析其與卵子、胚胎數(shù)量和質(zhì)量以及體外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization Embryo Transfer, IVF-ET)臨床結(jié)局的關(guān)系,探索APP及其代謝產(chǎn)物介導(dǎo)卵巢儲(chǔ)備功能下降發(fā)生的可能分子機(jī)制,為預(yù)防和治療卵巢衰老、卵巢儲(chǔ)備功能下降提供理論依據(jù)。 第一部分淀粉樣前體蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)及與IVF結(jié)局的相關(guān)性研究 研究目的： 檢測(cè)行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵巢壁層顆粒細(xì)胞中APP的蛋白和基因表達(dá)水平,并分析其在不同年齡患者中的表達(dá)差異及與IVF結(jié)局的相關(guān)性,研究APP蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況,并試圖探索其與卵巢衰老發(fā)生的關(guān)系。 研究方法： 1.收集自2012年12月-2013年9月于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵泡液,共192例。均為輸卵管因素或男性因素不孕癥患者。 2.將收集的所有卵泡液采用Percoll密度梯度離心法分離提純卵巢壁層顆粒細(xì)胞,用紅細(xì)胞裂解液裂解其中存在的紅細(xì)胞以減少實(shí)驗(yàn)干擾。 3.選取67例樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Bblot)檢測(cè)APP蛋白的表達(dá)水平,按患者年齡將壁層顆粒細(xì)胞蛋白組分為：A組：35歲,B組：》35歲40歲,C組：》40歲；選取138例進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)APPmRNA的表達(dá)水平,按患者年齡將壁層顆粒細(xì)胞基因組分為：A1組：35歲,B1組：》35歲40歲,C1組：》40歲。 4.收集所有標(biāo)本的臨床資料,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較各組中APP的表達(dá)水平及其與年齡、基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)(Antral Follicle Count, AFC)、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)等臨床參數(shù)的相關(guān)性,設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.壁層顆粒細(xì)胞中APP蛋白組：各組間年齡、AFC、Gn總量、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)均存在差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；／APP mRNA組：各組間年齡、AFC、HCG日E2水平、Gn總量、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)均存在差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.與低齡組相比,APP在中、高齡組壁層顆粒細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.12±0.75,2.02±1.17VS3.47±1.22,P0.05)；APPmRNA水平隨年齡增加也明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.88±1.34,3.58±2.58VS6.59±6.54,P0.05)； 3.壁層顆粒細(xì)胞中APP的蛋白表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.646,P=0.000)；與AFC、獲卵數(shù)及胚胎數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.553,P=0.000;r=-0.601,P=0.000；r=-586,P=0.000)；APP的基因表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.488,P=0.000)；與AFC、獲卵數(shù)及胚胎數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.189,P=0.026;r=-0.175,P=0.040;r=-0.177,P=0.037)。 研究結(jié)論： 1.卵巢壁層顆粒細(xì)胞中表達(dá)APP蛋白。隨著年齡增加,APP蛋白在卵巢顆粒細(xì)胞中的積累增加,可在一定程度上預(yù)測(cè)卵巢衰老。 2.卵巢顆粒細(xì)胞中APP的基因和蛋白表達(dá)水平與基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)、獲卵數(shù)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示APP的表達(dá)異�？赡軙�(huì)影響卵巢儲(chǔ)備功能。 第二部分淀粉樣前體蛋白及其代謝產(chǎn)物影響卵巢衰老發(fā)生的相關(guān)性研究 研究目的： 檢測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能不同患者的壁層顆粒細(xì)胞中APP、BACE1、Bcl-2及Bax的基因表達(dá)情況與卵泡液中Aβ42的水平,并分析各基因間的相關(guān)性及各基因與IVF結(jié)局的相關(guān)性,研究APP及其代謝產(chǎn)物介導(dǎo)卵巢功能下降的可能機(jī)制。研究方法： 1.收集自2012年12月-2013年9月于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵泡液,共80例。 2.將收集的所有卵泡液采用Percoll密度梯度離心法分離提純卵巢壁層顆粒細(xì)胞,用紅細(xì)胞裂解液裂解其中存在的紅細(xì)胞以減少實(shí)驗(yàn)干擾。收集第一管清亮卵泡液,離心取上清分裝凍存,備用。 3.根據(jù)患者年齡及卵巢功能評(píng)估指標(biāo)(bFSH、AMH)分組：①早發(fā)型卵巢衰老／隱匿性原發(fā)性卵巢功能不全(POA/OPOI)組：年齡38歲,bFSH10IU/L或AMH1.1ng/ml,19例；②生理性卵巢儲(chǔ)備功能下降(DOR)組：年齡》40歲,29例；③卵巢儲(chǔ)備功能正常(NOR)組：年齡38歲,bFSH10IU/L或AMH1.1ng/ml,32例。 4.應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)APP、Bax、Bcl-2及BACE1在顆粒細(xì)胞中的基因水平,酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)定量測(cè)定卵泡液中Aβ42水平。 5.收集所有標(biāo)本的臨床資料,采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較各組中APP的表達(dá)水平及其與年齡、AFC、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)等臨床參數(shù)的相關(guān)性,設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.三組的年齡、基礎(chǔ)FSH、AFC、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)及胚胎數(shù)相比有差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)：POA組與NOR組的年齡相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；POA組與DOR組的AFC、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)及胚胎數(shù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.與NOR相比,POA組及DOR組APP、BACE1、Bax mRNA水平升高,Bcl-2水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與POA組相比,DOR組的APPmRNA表達(dá)量顯著升高,BACE1、Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)量略低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.采用相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：APPmRNA與BACE1、Bax的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系,與Bcl-2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；APP、BACE1基因的表達(dá)與年齡呈正相關(guān)關(guān)系,Bcl-2的表達(dá)與年齡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；APP、BACE1、Bax基因的表達(dá)與AFC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,Bcl-2的表達(dá)與AFC呈正相關(guān)關(guān)系；APP、BACE1基因的表達(dá)與獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；BACE1、Bax基因的表達(dá)與胚胎數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4.與NOR相比,POA組及DOR組Aβ42水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；POA組的Aβ42的水平略高于DOR組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.采用相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：Aβ42與BACE1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.359,P=0.004),與Bcl-2及獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.265,P=0.039；r=-0.341,P=0.007)。 研究結(jié)論： 1.卵巢壁層顆粒細(xì)胞中APP、BACEl基因及卵泡液中Aβ42的表達(dá)水平增加可能與卵巢儲(chǔ)備功能下降有關(guān)。 2.高表達(dá)的APP可能通過(guò)降低卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2水平,從而影響卵泡的形成、顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡及卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟,這可能是APP及其代謝產(chǎn)物參與卵巢衰老發(fā)生的機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：卵巢衰老 卵巢儲(chǔ)備功能下降 顆粒細(xì)胞 淀粉樣前體蛋白 早發(fā)型卵巢衰老 卵巢儲(chǔ)備功能下降 β分泌酶 β樣淀粉蛋白 Bcl-2
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R711.75
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-24
• 第一部分 顆粒細(xì)胞中淀粉樣前體蛋白APP的表達(dá)水平與IVF結(jié)局的相關(guān)性研究24-47
• 前言24-25
• 材料與方法25-36
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析36-43
• 討論43-47
• 第二部分 淀粉樣前體蛋白及其代謝產(chǎn)物影響卵巢衰老發(fā)生的相關(guān)性研究47-64
• 前言47-48
• 材料與方法48-52
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析52-60
• 討論60-64
• 全文小結(jié)64-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 中英文縮略詞表70-71
• 攻讀學(xué)位期間成果71-72
• 致謝72-74

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本文編號(hào)：343600