本文關鍵詞：淀粉樣前體蛋白在卵巢顆粒細胞的表達及與卵巢衰老的相關性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵巢衰老尤其是早發(fā)型卵巢衰老(Premature Ovarian Aging, POA)伴隨著卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱,卵母細胞質(zhì)量下降是導致女性不孕的主要原因之一極大威脅著女性的生殖健康。既往對卵巢衰老的研究主要集中于尋找出可以預測、評判卵巢功能的指標,然而關于卵巢功能下降的確切機制研究甚少。普遍認為年齡是影響卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老的發(fā)生存在著極大的個體差異性,提示我們卵巢的內(nèi)部因素比年齡更能決定生育儲備功能。卵泡的生長發(fā)育異常、顆粒細胞的凋亡加速導致卵泡閉鎖是卵巢儲備功能下降的根本原因。研究參與調(diào)節(jié)卵泡生長發(fā)育、閉鎖過程的基因?qū)τ诮沂韭殉矁涔δ芟陆档臋C制有著重要意義。有關阿爾茨海默病(Alzheimer Disease,AD)的研究發(fā)現(xiàn)AD模型中的轉(zhuǎn)基因小鼠均出現(xiàn)不育,在AD中發(fā)揮關鍵性作用的淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)及其代謝產(chǎn)物的水平升高。APP蛋白屬I型膜整合糖蛋白,經(jīng)β和γ分泌酶連續(xù)裂解的過程中,APP被p分泌酶(p-site APP cleaving enzyme1, BACE1)水解產(chǎn)生一種APP羧基末端片段(C-terminal fragment,CTF)---C99。C99包含一個完整的β樣淀粉蛋白(Amyloid β peptide,Aβ)序列,隨后在跨膜區(qū)內(nèi)被γ分泌酶裂解生成具有神經(jīng)毒性的Ap。BACE1幾乎在人體所有的組織器官中均有表達,它是在APP的淀粉樣分解途徑中發(fā)揮關鍵作用的分泌酶,也是Aβ產(chǎn)生過程中的限速酶。Ap的產(chǎn)生、聚集和沉積被認為是AD發(fā)病機制的首要和中心環(huán)節(jié)。已證實轉(zhuǎn)基因小鼠中APP的高表達及其代謝產(chǎn)物Aβ的增加使細胞更易受到氧化應激的損傷、降低細胞的抗凋亡能力并導致細胞死亡,提示APP及其代謝產(chǎn)物可能通過增加細胞對氧化應激的敏感性、誘導細胞凋亡的途徑對卵巢內(nèi)卵泡的生長發(fā)育和凋亡以及卵巢功能產(chǎn)生影響,而關于APP蛋白在卵巢衰老中作用的研究尚屬空白。本研究擬采用分子生物學方法,從蛋白和基因水平探索APP蛋白、APP淀粉樣裂解途徑關鍵酶(BACE1)及凋亡調(diào)控基因Bcl-2家族成員在卵巢衰老患者的顆粒細胞中的表達情況,APP代謝產(chǎn)物Aβ42在卵泡液中的表達水平,分析其與卵子、胚胎數(shù)量和質(zhì)量以及體外受精-胚胎移植(In Vitro Fertilization Embryo Transfer, IVF-ET)臨床結(jié)局的關系,探索APP及其代謝產(chǎn)物介導卵巢儲備功能下降發(fā)生的可能分子機制,為預防和治療卵巢衰老、卵巢儲備功能下降提供理論依據(jù)。 第一部分淀粉樣前體蛋白在卵巢顆粒細胞中的表達及與IVF結(jié)局的相關性研究 研究目的： 檢測行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵巢壁層顆粒細胞中APP的蛋白和基因表達水平,并分析其在不同年齡患者中的表達差異及與IVF結(jié)局的相關性,研究APP蛋白在卵巢顆粒細胞中的表達情況,并試圖探索其與卵巢衰老發(fā)生的關系。 研究方法： 1.收集自2012年12月-2013年9月于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵泡液,共192例。均為輸卵管因素或男性因素不孕癥患者。 2.將收集的所有卵泡液采用Percoll密度梯度離心法分離提純卵巢壁層顆粒細胞,用紅細胞裂解液裂解其中存在的紅細胞以減少實驗干擾。 3.選取67例樣本進行蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Bblot)檢測APP蛋白的表達水平,按患者年齡將壁層顆粒細胞蛋白組分為：A組：35歲,B組：》35歲40歲,C組：》40歲；選取138例進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測APPmRNA的表達水平,按患者年齡將壁層顆粒細胞基因組分為：A1組：35歲,B1組：》35歲40歲,C1組：》40歲。 4.收集所有標本的臨床資料,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析比較各組中APP的表達水平及其與年齡、基礎竇狀卵泡數(shù)(Antral Follicle Count, AFC)、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)等臨床參數(shù)的相關性,設定檢驗水準a=0.05,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果： 1.壁層顆粒細胞中APP蛋白組：各組間年齡、AFC、Gn總量、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)均存在差異,具有統(tǒng)計學意義；／APP mRNA組：各組間年齡、AFC、HCG日E2水平、Gn總量、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)均存在差異,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.與低齡組相比,APP在中、高齡組壁層顆粒細胞中的蛋白表達水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(1.12±0.75,2.02±1.17VS3.47±1.22,P0.05)；APPmRNA水平隨年齡增加也明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(1.88±1.34,3.58±2.58VS6.59±6.54,P0.05)； 3.壁層顆粒細胞中APP的蛋白表達水平與年齡呈正相關關系(r=0.646,P=0.000)；與AFC、獲卵數(shù)及胚胎數(shù)呈負相關關系(r=-0.553,P=0.000;r=-0.601,P=0.000；r=-586,P=0.000)；APP的基因表達水平與年齡呈正相關關系(r=0.488,P=0.000)；與AFC、獲卵數(shù)及胚胎數(shù)呈負相關關系(r=-0.189,P=0.026;r=-0.175,P=0.040;r=-0.177,P=0.037)。 研究結(jié)論： 1.卵巢壁層顆粒細胞中表達APP蛋白。隨著年齡增加,APP蛋白在卵巢顆粒細胞中的積累增加,可在一定程度上預測卵巢衰老。 2.卵巢顆粒細胞中APP的基因和蛋白表達水平與基礎竇狀卵泡數(shù)、獲卵數(shù)均呈負相關關系,提示APP的表達異�？赡軙绊懧殉矁涔δ堋� 第二部分淀粉樣前體蛋白及其代謝產(chǎn)物影響卵巢衰老發(fā)生的相關性研究 研究目的： 檢測卵巢儲備功能不同患者的壁層顆粒細胞中APP、BACE1、Bcl-2及Bax的基因表達情況與卵泡液中Aβ42的水平,并分析各基因間的相關性及各基因與IVF結(jié)局的相關性,研究APP及其代謝產(chǎn)物介導卵巢功能下降的可能機制。研究方法： 1.收集自2012年12月-2013年9月于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者的卵泡液,共80例。 2.將收集的所有卵泡液采用Percoll密度梯度離心法分離提純卵巢壁層顆粒細胞,用紅細胞裂解液裂解其中存在的紅細胞以減少實驗干擾。收集第一管清亮卵泡液,離心取上清分裝凍存,備用。 3.根據(jù)患者年齡及卵巢功能評估指標(bFSH、AMH)分組：①早發(fā)型卵巢衰老／隱匿性原發(fā)性卵巢功能不全(POA/OPOI)組：年齡38歲,bFSH10IU/L或AMH1.1ng/ml,19例；②生理性卵巢儲備功能下降(DOR)組：年齡》40歲,29例；③卵巢儲備功能正常(NOR)組：年齡38歲,bFSH10IU/L或AMH1.1ng/ml,32例。 4.應用qRT-PCR檢測APP、Bax、Bcl-2及BACE1在顆粒細胞中的基因水平,酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)定量測定卵泡液中Aβ42水平。 5.收集所有標本的臨床資料,采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析比較各組中APP的表達水平及其與年齡、AFC、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)、胚胎數(shù)等臨床參數(shù)的相關性,設定檢驗水準a=0.05,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。 研究結(jié)果： 1.三組的年齡、基礎FSH、AFC、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)及胚胎數(shù)相比有差異,具有統(tǒng)計學意義。進一步進行兩兩比較發(fā)現(xiàn)：POA組與NOR組的年齡相比,差異無統(tǒng)計學意義；POA組與DOR組的AFC、HCG日E2水平、獲卵數(shù)、正常受精數(shù)及胚胎數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義。 2.與NOR相比,POA組及DOR組APP、BACE1、Bax mRNA水平升高,Bcl-2水平降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；與POA組相比,DOR組的APPmRNA表達量顯著升高,BACE1、Bcl-2、BaxmRNA的表達量略低,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.采用相關系數(shù)進行相關分析發(fā)現(xiàn)：APPmRNA與BACE1、Bax的表達呈正相關關系,與Bcl-2的表達呈負相關關系,具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；APP、BACE1基因的表達與年齡呈正相關關系,Bcl-2的表達與年齡呈負相關關系；APP、BACE1、Bax基因的表達與AFC呈負相關關系,Bcl-2的表達與AFC呈正相關關系；APP、BACE1基因的表達與獲卵數(shù)呈負相關關系；BACE1、Bax基因的表達與胚胎數(shù)呈負相關關系,均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.與NOR相比,POA組及DOR組Aβ42水平升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；POA組的Aβ42的水平略高于DOR組,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.采用相關系數(shù)進行相關分析發(fā)現(xiàn)：Aβ42與BACE1的表達呈正相關關系(r=0.359,P=0.004),與Bcl-2及獲卵數(shù)呈負相關關系(r=-0.265,P=0.039；r=-0.341,P=0.007)。 研究結(jié)論： 1.卵巢壁層顆粒細胞中APP、BACEl基因及卵泡液中Aβ42的表達水平增加可能與卵巢儲備功能下降有關。 2.高表達的APP可能通過降低卵巢顆粒細胞內(nèi)的Bcl-2水平,從而影響卵泡的形成、顆粒細胞的生長與凋亡及卵母細胞的發(fā)育成熟,這可能是APP及其代謝產(chǎn)物參與卵巢衰老發(fā)生的機制之一。
【關鍵詞】：卵巢衰老 卵巢儲備功能下降 顆粒細胞 淀粉樣前體蛋白 早發(fā)型卵巢衰老 卵巢儲備功能下降 β分泌酶 β樣淀粉蛋白 Bcl-2
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R711.75
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-24
• 第一部分 顆粒細胞中淀粉樣前體蛋白APP的表達水平與IVF結(jié)局的相關性研究24-47
• 前言24-25
• 材料與方法25-36
• 實驗結(jié)果和分析36-43
• 討論43-47
• 第二部分 淀粉樣前體蛋白及其代謝產(chǎn)物影響卵巢衰老發(fā)生的相關性研究47-64
• 前言47-48
• 材料與方法48-52
• 實驗結(jié)果和分析52-60
• 討論60-64
• 全文小結(jié)64-65
• 參考文獻65-70
• 中英文縮略詞表70-71
• 攻讀學位期間成果71-72
• 致謝72-74

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本文編號：343600