本文關(guān)鍵詞：過表達ICAM-1對間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性影響及自身免疫性甲狀腺炎動物模型的建立，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 1.構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-ICAM-1,探討細胞間粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)基因轉(zhuǎn)染對小鼠間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)生物學(xué)特性的影響。為進一步研究ICAM-1是否影響MSCs對自身免疫性甲狀腺炎(Autoimmune Thyroiditis, AIT)體內(nèi)治療效果提供實驗基礎(chǔ)。 2.利用外源性甲狀腺球蛋白免疫C57BL/6小鼠建立AIT的動物模型——實驗性自身免疫性甲狀腺炎(Experimental Autoimmune Thyroiditis, EAT),為下一步開展大規(guī)模體內(nèi)實驗提供穩(wěn)定可靠的動物模型。 方法： 1.通過RT-PCR方法擴增獲得小鼠脾細胞ICAM-1基因全長DNA,將其克隆至中間載體pMD19-T,行雙酶切及DNA測序鑒定后,將ICAM-1基因連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1七,對重組載體MIGR1-ICAM-1進行雙酶切、RT-PCR及DNA測序分析。 2.將獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒MIGR1-ICAM-1及空質(zhì)粒MIGR1均加入包裝質(zhì)粒ECOS后分別轉(zhuǎn)染人胚腎細胞(T293細胞),將獲得攜帶ICAM-1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒MIGR1-ICAM-1及空載體逆轉(zhuǎn)錄病毒MIGR1,分別感染C3H10T1/2細胞,熒光倒置顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達, real-time PCR和流式細胞術(shù)檢測ICAM-1在基因水平和蛋白水平的表達。同時檢測三種細胞的形態(tài)、表型、生長特點及成脂成骨分化等一般生物學(xué)特性；并通過淋巴母細胞轉(zhuǎn)化實驗(Lymphocyte transformation test, LTT)及混合淋巴細胞反應(yīng)實驗(Mixed lymphocyte reaction, MLR)檢測三種細胞的免疫學(xué)特性。 3.建立EAT動物模型,將5周齡雌性C57BL/6小鼠于第0d和第14d用豬甲狀腺免疫球蛋白(Porcine Thyroglobuli, PTg)及弗氏佐劑(Freund's adjuvant, FA)進行兩次免疫；于實驗第28d眼球取血,測血清甲狀腺球蛋白抗體(Thyroglobulin Antibody, TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(Antithyroid Peroxidase Antibodies,TPOAb)、甲狀腺微粒體抗體(Thyroid microsomal Autoantibody, TMAb)水平,并分離甲狀腺組織行HE染色及組織病分析。 結(jié)果： 1.對重組載體MIGR1-ICAM-1雙酶切和RT-PCR電泳均顯示獲得1700bpICAM-1目的基因片段；DNA測序結(jié)果顯示與基因文庫中的小鼠ICAM-1基因序列完全相同,且插入方向正確,從而證實成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-ICAM-1。 2.逆轉(zhuǎn)錄病毒感染C3H10T1/2細胞后,熒光倒置顯微鏡下可見絕大部分細胞表達綠色熒光；real-time PCR和流式細胞術(shù)分別在轉(zhuǎn)錄水平(相對表達量1625.82+119.42)和蛋白水平(表達量90.3%)證實ICAM-1在C3H10T1/2細胞中均有高表達,從而證明獲得穩(wěn)定過表達ICAM-1的間充質(zhì)干細胞系C3H10T1/2(C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC)。 3.進一步對過表達ICAM-1的C3H10T1/2細胞的生長特性、誘導(dǎo)分化能力及免疫學(xué)功能進行研究,結(jié)果表明,過表達ICAM-1可使C3H10T1/2細胞(29.18±2.47)%處于S期,且倍增時間縮短。在成脂誘導(dǎo)分化中,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC獲得脂肪細胞數(shù)顯著降低(12.18±3.83/孔),且脂滴變��；real-time PCR檢測成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα和PPARy的表達均顯著下調(diào)；同樣,在成骨分化中,過表達ICAM-1可使C3H10T1/2成骨分化的堿性磷酸酶活性及礦化骨結(jié)節(jié)形成能力顯著下降,關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osteocalcin在mRNA表達水平亦顯著降低,提示過表達ICAM-1可顯著降低MSCs的成脂和成骨分化能力。 4.利用淋巴母細胞轉(zhuǎn)化實驗(Lymphocyte transformation test, LTT)和混合淋巴細胞反應(yīng)(Mixed lymphocyte reaction, MLR)對過表達ICAM-1的MSCs進行免疫功能檢測,結(jié)果顯示,在LTT體系中,當(dāng)MSCs:T細胞分別為1：40和1：5時,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC與對照組C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分別為(1955.25±292.60)、(2285.33±303.67)；(812.00±21.17)、(1335.00±209.18)；同樣,在MSCs作為滋養(yǎng)層的MLR反應(yīng)體系中,當(dāng)刺激細胞：效應(yīng)細胞為1：1和1：25時,C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC與對照組C3H10T1/2-MIGR1/MSC的cpm值分別為(1598.50±110.74)、(1859.00±111.25)；(1147.50±55.91)、(1493.00±98.33)。提示過表達ICAM-1的MSCs具有顯著抑制T細胞增殖的能力,且具有劑量依賴性,隨著MSCs數(shù)量的增加,其抑制能力逐漸增強。 5.C57BL/6小鼠經(jīng)外源性甲狀腺球蛋白皮下免疫誘導(dǎo)后,結(jié)果顯示,模型組小鼠血清中TPOAb、TMAb、TgAb的水平[(60.36±4.53)、(67.47±6.25)、(65.67±5.35)]均顯著高于對照組小鼠[(21.45±4.66)、(7.68±2.76)、(7.59±2.23)]；甲狀腺病理顯示濾泡間質(zhì)存在淋巴細胞浸潤情況,具有典型EAT特征。 結(jié)論： 1.本研究通過構(gòu)建ICAM-1的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MIGR1-ICAM-1,成功獲得穩(wěn)定過表達ICAM-1的間充質(zhì)干細胞系C3H10T1/2-MIGR1-ICAM-1/MSC。 2.對過表達ICAM-1的MSCs生物學(xué)特性研究表明,過表達ICAM-1可使MSCs增殖能力增強、成脂成骨分化能力減弱；最為關(guān)鍵的是,過表達ICAM-1可顯著增強MSCs的免疫抑制作用,為進一步研究ICAM-1是否影響MSCs對AIT體內(nèi)治療效果提供實驗基礎(chǔ)。 3.同時本研究利用外源性甲狀腺自身抗原免疫方法成功建立EAT,從而證實該實驗方法建模成功率高、可行性強并且可重復(fù)性高。為下一步的體內(nèi)實驗提供了穩(wěn)定可靠的動物模型。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細胞 C3H10T1/2細胞 細胞間粘附分子1 實驗性自身免疫性甲狀腺炎
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R-332;R581.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語/符號說明11-13
• 前言13-16
• 研究現(xiàn)狀、成果13-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、ICAM-1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建與鑒定16-31
• 實驗流程16-17
• 1.1. 對象和方法17-26
• 1.2. 結(jié)果26-29
• 1.3. 討論29-30
• 1.4. 小結(jié)30-31
• 二、過表達ICAM-1對間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性的影響31-60
• 實驗流程31-32
• 2.1 對象和方法32-42
• 2.2 結(jié)果42-57
• 2.3 討論57-59
• 2.4 小結(jié)59-60
• 三、實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型的建立60-68
• 實驗流程60-61
• 3.1 對象和方法61-64
• 3.2 結(jié)果64-66
• 3.3 討論66-67
• 3.4 小結(jié)67-68
• 結(jié)論68-69
• 參考文獻69-75
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明75-76
• 綜述 間充質(zhì)干細胞的免疫調(diào)節(jié)與臨床應(yīng)用76-85
• 綜述參考文獻82-85
• 致謝85

【共引文獻】

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本文編號：307766