骨質(zhì)疏松癥是主要表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨骼強(qiáng)度和負(fù)荷承受能力降低,易于發(fā)生脆性骨折的一類全身性骨代謝障礙疾病,也是多種骨破壞性疾病共有的病理損害。骨質(zhì)疏松發(fā)病率高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,給社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。正常骨代謝主要依賴于破骨細(xì)胞發(fā)揮的骨吸收作用和成骨細(xì)胞發(fā)揮的成骨作用之間的平衡。任何原因?qū)е逻@種平衡的破壞都會引起骨代謝性相關(guān)疾病。其中,破骨細(xì)胞活性和功能的增強(qiáng)在這一過程中發(fā)揮著極其重要的作用。核因子κB受體活化因子配體(RANKL,Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand)對破骨細(xì)胞的分化、成熟及功能都發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。RANKL結(jié)合到破骨前體細(xì)胞的核因子κB活化因子受體(RANK)上,啟動下游NF-κB,P38,ERK,JNK等信號通路,刺激破骨細(xì)胞的分化、成熟及功能。阻斷RANKL與RANK的結(jié)合,可抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟�？筊ANKL單克隆抗體Denosumab可以特異性地阻斷RANKL與其受體的結(jié)合,有效地的抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟和功能,對骨質(zhì)疏松等骨吸收性疾病療效明顯。最近研究表明,在自體蛋白中插入非天然氨基酸(p-硝基苯丙氨酸)可以突破免疫耐受,使機(jī)體產(chǎn)生針對自體蛋白高滴度的抗體。本研究依據(jù)小鼠RANKL的三維晶體結(jié)構(gòu)信息,利用p-硝基苯丙氨酸插入這一全新的技術(shù)對RANKL進(jìn)行多點(diǎn)定向插入修飾,探討p-硝基苯丙氨酸突變的小鼠RANKL蛋白的克隆、原核表達(dá)和純化,構(gòu)建和篩選針對自體蛋白RANKL的高效疫苗,并探索其對OVX小鼠骨質(zhì)疏松的治療作用。【方法和結(jié)果】(1)首先通過RT-PCR克隆了具有活性的小鼠RANKL(mRANKL)的胞外段基因,將編碼第164、234、240、272位氨基酸的密碼子突變成能編碼p-硝基苯丙氨酸(pNO_2Phe)的密碼子,然后構(gòu)建了pET28a-pNO_2Phe mRANKL重組表達(dá)載體并經(jīng)測序驗(yàn)證構(gòu)建成功。(2)成功將四個突變的pET28a-pNO_2Phe mRANKL重組表達(dá)載體與pEVOL質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)原核表達(dá)菌中,用阿拉伯糖和IPTG誘導(dǎo),成功表達(dá)并純化了目的蛋白(這四個突變的mRANKL蛋白分別簡寫為F~(164)pNO_2Phe、Y~(234)pNO_2Phe、Y~(240)pNO_2Phe和Y~(272)pNO_2Phe)。經(jīng)SDS-PAGE與Western Blot檢測,該蛋白與預(yù)測蛋白大小一致;通過高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測進(jìn)一步證實(shí)成功插入了p-硝基苯丙氨酸。(3)以純化蛋白作為免疫原,采用多位點(diǎn)皮下重復(fù)注射的方法免疫小鼠,采用Western Blot和間接ELISA分別檢測抗mRANKL抗體滴度和抗血清活性。結(jié)果表明,成功制備了小鼠抗mRANKL的抗血清,該抗血清具有較高的活性。Y~(234)pNO_2Phe和Y~(240)pNO_2Phe所產(chǎn)生的抗體滴度更高,且能維持168天。其抗血清在體外可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。(4)通過建立小鼠OVX骨質(zhì)疏松模型,探究了疫苗對小鼠骨質(zhì)疏松的治療效果。結(jié)果顯示,篩選出來的兩個疫苗(Y~(234)pNO_2Phe和Y~(240)pNO_2Phe)對OVX骨質(zhì)疏松小鼠均具有一定的治療效果。【結(jié)論】通過本實(shí)驗(yàn),我們首次克隆并表達(dá)了p-硝基苯丙氨酸突變的小鼠RANKL(mRANKL)的胞外段,通過高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜檢測驗(yàn)證了p-硝基苯丙氨酸的成功插入;并從中篩選出了兩個能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度抗mRANKL抗體的疫苗(Y~(234)pNO_2Phe和Y~(240)pNO_2Phe),用該疫苗免疫小鼠獲得的抗血清在體外可抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成,而且疫苗對OVX骨質(zhì)疏松小鼠具有一定的治療效果。這些結(jié)果為進(jìn)一步探究治療骨質(zhì)疏松的新方法打下了一定的基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

RANKL 的晶體結(jié)構(gòu)。引自（Lam J, et al. J Clin Invest. 2001, 108(7): 9L 以三聚體的形式發(fā)揮生物學(xué)功能，其介導(dǎo)的 RANK 聚集是早聚體的 RANKL 與三個受體 RANK 結(jié)合，使得 RANK 在細(xì)胞表NF 受體相關(guān)因子（TRAF）并激活下游的細(xì)胞信號分子，如 NF-，Akt 等信號途徑，進(jìn)而激活 NFATcl, c-fos 等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，誘成熟和功能[39-41]。因此，RANKL 對于破骨細(xì)胞的增殖、分化、或缺的。是，體內(nèi)自然存在著 OPG/RANKL-RANK 信號通路的“緩剎機(jī)胞活性的適度性。骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分泌的一種可溶性蛋egerin）可以和 RANKL 結(jié)合，但不能向細(xì)胞內(nèi)傳遞分化信號，的破骨細(xì)胞形成及功能，因此 OPG 也被稱為“誘騙受體”（decoy/RANKL-RANK 這種正性信號與競爭性阻斷效應(yīng)并存的信號通

圖 2 OPG–RANK–RANKL 信號通路簡圖引自（Nakashima T, et al.Ann NYAcad Sci. 2011 Dec;1240:E13-18.）3. 基于 OPG/RANKL-RANK 信號通路對骨質(zhì)疏松的治療基于對骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制分子水平的研究，研究者們一直致力于尋求靶向阻斷RANKL 與 RANK 結(jié)合的方法，以實(shí)現(xiàn)對骨質(zhì)疏松性疾病更加有效地治療。最初用于前期臨床研究拮抗 RANKL 的是 OPG-Fc 融合蛋白，但由于其能針對體內(nèi)內(nèi)源性O(shè)PG 發(fā)生中和性免疫應(yīng)答，形成一種拮抗 OPG 的中和抗體，從而增加了安全風(fēng)險[51]。為了克服 OPG-Fc 的不足，隨著單克隆抗體技術(shù)的不斷發(fā)展和疫苗研究的不斷深入，產(chǎn)生了針對 RANKL 免疫治療骨質(zhì)疏松的新策略。3.1 重組 OPG 與骨質(zhì)疏松通過提高 OPG 的水平，競爭性阻斷 RANKL 與 RANK 的結(jié)合，可以阻止破骨細(xì)胞的分化和成熟，從而實(shí)現(xiàn)抗骨吸收的作用。盡管 OPG 在體外能高效地抑制破骨細(xì)

圖 3 苯丙氨酸、酪氨酸與 p-硝基苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)。（苯丙氨酸：phenylalanine，相對分子質(zhì)量為 165.19；酪氨酸：tyrosine，相對分子質(zhì)量為 181.20；p-硝基苯丙氨酸：p-nitrophenylalanine，相對分子質(zhì)量為 210.19）。引自（Grunewald J, et al. Proc NatlAcadSci USA. 2008, 105(32): 11276-11280）基于以上背景，本研究依據(jù)小鼠 RANKL 的三維晶體結(jié)構(gòu)信息，利用非天然氨基酸插入這一全新的技術(shù)對 RANKL 進(jìn)行定點(diǎn)插入修飾。首先通過 RT-PCR 克隆了具有活性的小鼠 RANKL（mRANKL）的胞外段基因，將編碼第 164、234、240、272位氨基酸的密碼子突變成能編碼 p-硝基苯丙氨酸的密碼子（TAG），然后構(gòu)建原核表達(dá)載體并在原核細(xì)胞中表達(dá)，以 p-硝基苯丙氨酸突變的 mRANKL（pNO2PhemRANKL）為抗原免疫小鼠，成功制備了小鼠抗 mRANKL 的抗血清，這些抗血清均具有較高的抗體滴度和活性；從中篩選出來的第 234、240 位 p-硝基苯丙氨酸突變
【參考文獻(xiàn)】

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1 趙燕玲,潘子昂,王石麟,王虔,劉京萍,劉忠厚;中國原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥流行病學(xué)[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;1998年01期

本文編號：2889913