類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以炎性滑膜炎特點(diǎn)的慢性自身免疫性疾病。中性粒細(xì)胞在RA的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。在RA發(fā)生的早期,中性粒細(xì)胞通過分泌大量的炎性介質(zhì),造成組織的炎性損傷。另外,中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)還與早期RA病人體內(nèi)自身抗體的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,中性粒細(xì)胞是RA治療的重要靶點(diǎn)。雷公藤是臨床上治療RA的有效藥物,但是其作用機(jī)制尚未完全闡明。鑒于中性粒細(xì)胞在RA發(fā)病早期發(fā)揮的重要作用,本研究通過分析雷公藤主要活性成分雷公藤甲素、雷公藤紅素對(duì)中性粒細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用來闡釋雷公藤治療RA的免疫機(jī)制。我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明,雷公藤甲素、雷公藤紅素通過抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),從而達(dá)到治療RA的效果。該發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明雷公藤治療RA的分子機(jī)制,揭示雷公藤起效時(shí)間明顯早于其他藥物的機(jī)制,從而為指導(dǎo)雷公藤臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。第一部分雷公藤甲素通過抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)治療RA目的:檢測雷公藤甲素對(duì)RA的治療作用和對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其關(guān)聯(lián)。方法1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選8周齡的C57BL/6小鼠通過佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(adjuvant-induced arthritis,AA)方法造模,造模成功后對(duì)治療組AA小鼠給予雷公藤甲素70 μg/kg/d腹腔注射。治療過程中定期測定關(guān)節(jié)直徑并且進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。治療周期結(jié)束后通過H-E染色對(duì)炎癥關(guān)節(jié)進(jìn)行病理分析。通過免疫組化法分析中性粒細(xì)胞相關(guān)的髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和彈性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)在炎癥關(guān)節(jié)的表達(dá)水平。通過ELISA法檢測小鼠血清中炎性因子的表達(dá)水平。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分離純化正常小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,給予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激,同時(shí)分別加入0、10、50、200 nM的雷公藤甲素,2 h后收集中性粒細(xì)胞純化RNA,使用Q-PCR法分析TNFα、IL-6、GM-CSF、CCL-5的基因表達(dá)水平。同時(shí)收集細(xì)胞上清,通過ELISA法檢測炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-6的蛋白表達(dá)量。通過Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3和p-ERK的蛋白質(zhì)表達(dá)水平來評(píng)價(jià)雷公藤甲素對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響。通過免疫熒光法來檢測雷公藤甲素對(duì)NETs的形成影響。結(jié)果:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,雷公藤甲素顯著緩解AA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀。治療組小鼠與未治療組小鼠相比,炎癥關(guān)節(jié)腫脹程度明顯減輕,關(guān)節(jié)炎評(píng)分也顯著降低。H-E染色發(fā)現(xiàn),治療組炎癥關(guān)節(jié)部位的炎癥程度得到明顯改善。免疫組化法發(fā)現(xiàn)治療組小鼠的MPO和NE表達(dá)減少。ELISA法發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素可以明顯降低AA小鼠血清TNFα和IL-6的含量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠抑制中性粒細(xì)胞表達(dá)和分泌炎性細(xì)胞因子。Q-PCR法發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠劑量依賴性地抑制LPS刺激后中性粒細(xì)胞TNFα、IL-6、GM-CSF、CCL-5等細(xì)胞因子和趨化因子mRNA的表達(dá)。ELISA法發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠顯著抑制中性粒細(xì)胞TNFα、IL-6等炎癥因子的分泌。雷公藤甲素可以增加促凋亡蛋白表達(dá),減少抑制凋亡蛋白的表達(dá),減少ERK蛋白的磷酸化,增加caspase-3的活化,從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡。雷公藤甲素還能夠抑制NETs的形成。結(jié)論:雷公藤甲素可以通過抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來治療RA。第二部分雷公藤紅素通過抑制中性粒細(xì)胞炎癥治療RA目的:檢測雷公藤紅素對(duì)RA的治療作用和對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其關(guān)聯(lián)。方法:1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選8周齡的C57BL/6小鼠使用AA法制備關(guān)節(jié)炎模型,造模成功后對(duì)治療組AA小鼠給予雷公藤紅素0.5 mg/kg/d腹腔注射。治療過程中定期測定關(guān)節(jié)直徑并且進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評(píng)分。治療周期結(jié)束后通過H-E染色對(duì)炎癥關(guān)節(jié)進(jìn)行病理分析。通過免疫組化法分析檢測炎癥關(guān)節(jié)部位中性粒細(xì)胞相關(guān)的MPO和NE的表達(dá)量。通過ELISA法檢測小鼠血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平。2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分離純化正常小鼠腹腔中性粒細(xì)胞,給予LPS刺激,同時(shí)分別加入0、1、5、10 μM的雷公藤紅素,2h后收集中性粒細(xì)胞純化RNA,使用Q-PCR法分析TNFα、IL-6的基因表達(dá)。同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,通過ELISA法檢測炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-6的蛋白表達(dá)量。通過Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3等的蛋白質(zhì)表達(dá)水平來評(píng)價(jià)雷公藤紅素對(duì)中性粒細(xì)胞凋亡的影響。通過免疫熒光法來檢測雷公藤紅素對(duì)NETs的形成影響。結(jié)果:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面,雷公藤紅素能夠顯著減輕AA小鼠關(guān)節(jié)腫脹,關(guān)節(jié)炎評(píng)分也顯著降低。H-E染色發(fā)現(xiàn),治療組炎癥關(guān)節(jié)部位的炎癥程度得到明顯改善。免疫組化法發(fā)現(xiàn)治療組小鼠的MPO和NE表達(dá)減少。ELISA法發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以明顯降低AA小鼠血清TNFα和IL-6的含量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面,雷公藤紅素抑制LPS刺激后中性粒細(xì)胞表達(dá)和分泌炎性細(xì)胞因子。Q-PCR法發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能夠劑量依賴性地抑制LPS刺激后中性粒細(xì)胞TNFα、IL-6的表達(dá)。ELISA法發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能夠顯著抑制中性粒細(xì)胞TNFα、IL-6的分泌。雷公藤紅素可以增加促凋亡蛋白的表達(dá),減少抑制凋亡蛋白的表達(dá),增加caspase-3的活化,從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡。雷公藤紅素還能夠抑制NETs的形成。結(jié)論:雷公藤紅素通過抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來治療RA。
【學(xué)位單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：R593.22
【部分圖文】：

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用ＡＡ小鼠作為研究ＲＡ的動(dòng)物模型，研究雷公藤甲素對(duì)ＡＡ小??鼠抗炎方面的作用。造模成功后，我們給予毎只治療組小鼠雷公藤甲素７０ｕｇ／ｋｇ／ｄ腹腔??注射。如圖１－１所示，與未治療組相比，雷公藤甲素治療組的小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度明顯緩??解。另外治療后ＡＡ小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分也明顯降低。未治療組的ＡＡ小鼠關(guān)節(jié)處都有比??較嚴(yán)重的紅腫。而治療組的ＡＡ小鼠關(guān)節(jié)炎部位只有輕度紅腫。我們還對(duì)炎癥部位做了??病理分析，小鼠關(guān)節(jié)病理Ｈ－Ｅ染色發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素治巧組炎癥部位病理切片的炎癥??程度明顯較未治療組有得到改善，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。同時(shí)甲素治療組還有軟骨和??骨質(zhì)破壞的明顯減輕等表現(xiàn)。說明雷公藤甲素對(duì)ＡＡ小鼠有很好的關(guān)節(jié)保護(hù)作用。??５６??

圖１－２免疫組化法分析關(guān)節(jié)處ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)??免疫組化法分析小鼠關(guān)節(jié)ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)

?裝議達(dá)曝囊Ｓ義蕃筆舊??酵把？’規(guī)端義議繁纖難績??圖１－２免疫組化法分析關(guān)節(jié)處ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)??免疫組化法分析小鼠關(guān)節(jié)ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)。Ｃｏｎｔｒｏｌ組表示未造模的完全正常小鼠關(guān)節(jié)ＭＰＯ??和ＮＥ的表達(dá)；ＲＡ組表示未治療組ＡＡ小鼠炎癥關(guān)節(jié)部位ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)；Ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ表示雷公??藤甲素治療組小鼠炎癥關(guān)節(jié)部位ＭＰＯ和ＮＥ的表泣。結(jié)果顯示，Ｃｏｎｔｒｏｌ組中，正常小鼠關(guān)節(jié)表達(dá)??ＭＰＯ和Ｎ巨極少。與Ｃｏｎｔｒｏｌ組小鼠關(guān)節(jié)相比，ＲＡ組小鼠關(guān)節(jié)部位ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)明顯增多，??呈環(huán)狀包繞分布，圖中箭頭所指處的棟色即為ＲＡ組中鳥表達(dá)的ＭＰＯ和ＮＥ。由于中性粒細(xì)胞多分??布于ＲＡ新生血管周圍，故ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)也多為環(huán)狀包繞分布。雷公藤甲素治療組與未治療組??相比，免疫組化法發(fā)現(xiàn)ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)明顯減少。說明雷公藤甲素能夠抑制ＡＡ小鼠關(guān)節(jié)炎部位??ＭＰＯ和ＮＥ的表達(dá)。??５８??
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