發(fā)布時間：2020-11-18 02:55

　　 目的:本課題組前期在篩選與胰腺發(fā)育相關(guān)的miRNA時發(fā)現(xiàn)miR-152-3p參與胰島β細(xì)胞分化、凋亡過程,但其潛在的作用及機(jī)制尚不明確,因此本研究主要探討miR-152-3p在人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)向IPCs分化過程中的作用,是否可促進(jìn)hiPSCs向胰島素分泌細(xì)胞分化的效率和成熟度,為干細(xì)胞治療糖尿病奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:采用四步法誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)hi PSCs向IPCs分化,倒置顯微鏡觀察細(xì)胞分化過程中的形態(tài)變化;S-poly(T)plus Real-Time PCR檢測各分化階段miR-152-3p的表達(dá)水平;利用miR-152-3p過表達(dá)或抑制表達(dá)慢病毒載體分別感染hiPSCs,構(gòu)建miR-152-3p過表達(dá)或抑制表達(dá)hiPSCs細(xì)胞系;分別誘導(dǎo)miR-152-3p過表達(dá)或抑制表達(dá)hiPSCs分化為IPCs,分階段收集限定性內(nèi)胚層細(xì)胞、胰腺祖細(xì)胞、胰島素分泌細(xì)胞,Real-Time PCR檢測各階段標(biāo)志性基因Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA的表達(dá)水平;免疫熒光檢測各階段關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin的表達(dá)水平和定位,流式細(xì)胞術(shù)檢測各階段分化效率,葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)檢測胰島素分泌細(xì)胞對葡萄糖的應(yīng)答能力。結(jié)果:miR-152-3p在hiPSCs向IPCs分化過程中表達(dá)呈持續(xù)上調(diào),在限定性內(nèi)胚層階段、前腸管細(xì)胞階段、胰腺祖細(xì)胞階段、胰島素分泌細(xì)胞階段miR-152-3p表達(dá)分別增加約2倍、10倍、70倍、200倍;在成功構(gòu)建的過表達(dá)或抑制表達(dá)的2個hiPSCs系中,miR-152-3p過表達(dá)hiPSCs細(xì)胞系中miR-152-3p表達(dá)上調(diào)約18倍,miR-152-3p抑制表達(dá)hiPSCs細(xì)胞系中mi R-152-3p下游靶基因DNMT1的表達(dá)水平上調(diào)約4倍;miR-152-3p抑制表達(dá)細(xì)胞系中Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA基因表達(dá)水平顯著上調(diào),miR-152-3p過表達(dá)細(xì)胞系則顯著下調(diào);miR-152-3p抑制表達(dá)細(xì)胞系中Sox17~+Foxa2~+、PDX1~+NKX6.1~+雙陽性細(xì)胞和insulin~+細(xì)胞比例明顯高于對照組和miR-152-3p過表達(dá)組(P0.05),而miR-152-3p過表達(dá)細(xì)胞系中Sox17~+Foxa2~+、PDX1~+NKX6.1~+雙陽性細(xì)胞和insulin~+細(xì)胞數(shù)量較對照組少(P0.05);對照組IPCs分化效率為20.8%,miR-152-3p抑制表達(dá)組IPCs的分化效率為28.5%,miR-152-3p過表達(dá)組IPCs分化效率為11.2%,抑制表達(dá)組分化效率明顯高于對照組和過表達(dá)組(P0.05),而過表達(dá)組分化效較對照組低(P0.05);葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抑制miR-152-3p表達(dá)組與對照組和過表達(dá)miR-152-3p組比較,胰島素分泌量和C-肽分泌量顯著升高(P0.01),而過表達(dá)miR-152-3p組較對照組胰島素和C-肽分泌均有所下降(P0.05)。結(jié)論:本研究構(gòu)建了mi R-152-3p過表達(dá)或抑制表達(dá)的hiPSCs細(xì)胞系,誘導(dǎo)分化過程中證明抑制miR-152-3p可促進(jìn)各分化階段標(biāo)志性基因和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),促使hiPSCs向IPCs分化,提高IPCs的分化效率和胰島素的分泌能力;而過表達(dá)miR-152-3p可抑制hiPSCs向IPCs分化和胰島素分泌。表明miR-152-3p在hiPSCs體外分化為IPCs的過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
【學(xué)位單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

圖 1 S-Poly(T) Plus 法檢測 miRNA 的原理圖 細(xì)胞總 RNA 的提取孔板接種 hiPSCs，四步法誘導(dǎo)分化至 DE、PP、IPCs 階段。 1mL DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2～3 次，隨后加 1mL/孔 Trizol 裂下放置 3～5min 后，用 1mL 移液器輕輕吹打孔底使細(xì)胞脫落 ，直至細(xì)解，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的 1.5mL Ep 管，繼續(xù)使細(xì)胞充分裂，置于-80℃冰箱長期保存。入 200μL 三氯甲烷，用 VORTEX 劇烈震蕩 30 秒，室溫下靜置 10mi前預(yù)冷 4℃高速離心機(jī)，離心力 12000×g，離心 15min。移離心后的水相層至新的無 RNA 酶的 1.5mL Ep 管。(注：勿吸到中間有機(jī)相)等體積的、-20℃預(yù)冷的異丙醇，上下顛倒數(shù)次使其充分混勻，-20℃冰。

圖 2 hiPSCs 向 IPCs 分化過程中的形態(tài)變化(放大倍數(shù)：100×)信息學(xué)分析 miR-152-3p 的功能富集 DIANATOOLS 數(shù)據(jù)庫分析 miR-152-3p 與胰島β細(xì)胞分化、凋，如圖 4 所示。

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 李蘭蘭圖 2 hiPSCs 向 IPCs 分化過程中的形態(tài)變化(放大倍數(shù)：100×)3.2 生物信息學(xué)分析 miR-152-3p 的功能富集通過 DIANATOOLS 數(shù)據(jù)庫分析 miR-152-3p 與胰島β細(xì)胞分化、凋亡過程及功能相關(guān)，如圖 4 所示。
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本文編號：2888254