發(fā)布時間：2020-11-18 02:55

　　 目的:本課題組前期在篩選與胰腺發(fā)育相關的miRNA時發(fā)現(xiàn)miR-152-3p參與胰島β細胞分化、凋亡過程,但其潛在的作用及機制尚不明確,因此本研究主要探討miR-152-3p在人誘導多能性干細胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)向IPCs分化過程中的作用,是否可促進hiPSCs向胰島素分泌細胞分化的效率和成熟度,為干細胞治療糖尿病奠定實驗基礎。方法:采用四步法誘導方案誘導hi PSCs向IPCs分化,倒置顯微鏡觀察細胞分化過程中的形態(tài)變化;S-poly(T)plus Real-Time PCR檢測各分化階段miR-152-3p的表達水平;利用miR-152-3p過表達或抑制表達慢病毒載體分別感染hiPSCs,構建miR-152-3p過表達或抑制表達hiPSCs細胞系;分別誘導miR-152-3p過表達或抑制表達hiPSCs分化為IPCs,分階段收集限定性內胚層細胞、胰腺祖細胞、胰島素分泌細胞,Real-Time PCR檢測各階段標志性基因Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA的表達水平;免疫熒光檢測各階段關鍵轉錄因子Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin的表達水平和定位,流式細胞術檢測各階段分化效率,葡萄糖刺激實驗檢測胰島素分泌細胞對葡萄糖的應答能力。結果:miR-152-3p在hiPSCs向IPCs分化過程中表達呈持續(xù)上調,在限定性內胚層階段、前腸管細胞階段、胰腺祖細胞階段、胰島素分泌細胞階段miR-152-3p表達分別增加約2倍、10倍、70倍、200倍;在成功構建的過表達或抑制表達的2個hiPSCs系中,miR-152-3p過表達hiPSCs細胞系中miR-152-3p表達上調約18倍,miR-152-3p抑制表達hiPSCs細胞系中mi R-152-3p下游靶基因DNMT1的表達水平上調約4倍;miR-152-3p抑制表達細胞系中Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA基因表達水平顯著上調,miR-152-3p過表達細胞系則顯著下調;miR-152-3p抑制表達細胞系中Sox17~+Foxa2~+、PDX1~+NKX6.1~+雙陽性細胞和insulin~+細胞比例明顯高于對照組和miR-152-3p過表達組(P0.05),而miR-152-3p過表達細胞系中Sox17~+Foxa2~+、PDX1~+NKX6.1~+雙陽性細胞和insulin~+細胞數(shù)量較對照組少(P0.05);對照組IPCs分化效率為20.8%,miR-152-3p抑制表達組IPCs的分化效率為28.5%,miR-152-3p過表達組IPCs分化效率為11.2%,抑制表達組分化效率明顯高于對照組和過表達組(P0.05),而過表達組分化效較對照組低(P0.05);葡萄糖刺激實驗結果表明,抑制miR-152-3p表達組與對照組和過表達miR-152-3p組比較,胰島素分泌量和C-肽分泌量顯著升高(P0.01),而過表達miR-152-3p組較對照組胰島素和C-肽分泌均有所下降(P0.05)。結論:本研究構建了mi R-152-3p過表達或抑制表達的hiPSCs細胞系,誘導分化過程中證明抑制miR-152-3p可促進各分化階段標志性基因和關鍵轉錄因子的表達,促使hiPSCs向IPCs分化,提高IPCs的分化效率和胰島素的分泌能力;而過表達miR-152-3p可抑制hiPSCs向IPCs分化和胰島素分泌。表明miR-152-3p在hiPSCs體外分化為IPCs的過程中發(fā)揮負調控作用。
【學位單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R587.1
【部分圖文】：

圖 1 S-Poly(T) Plus 法檢測 miRNA 的原理圖 細胞總 RNA 的提取孔板接種 hiPSCs，四步法誘導分化至 DE、PP、IPCs 階段。 1mL DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌細胞 2～3 次，隨后加 1mL/孔 Trizol 裂下放置 3～5min 后，用 1mL 移液器輕輕吹打孔底使細胞脫落 ，直至細解，將細胞裂解液轉移至無RNA酶的 1.5mL Ep 管，繼續(xù)使細胞充分裂，置于-80℃冰箱長期保存。入 200μL 三氯甲烷，用 VORTEX 劇烈震蕩 30 秒，室溫下靜置 10mi前預冷 4℃高速離心機，離心力 12000×g，離心 15min。移離心后的水相層至新的無 RNA 酶的 1.5mL Ep 管。(注：勿吸到中間有機相)等體積的、-20℃預冷的異丙醇，上下顛倒數(shù)次使其充分混勻，-20℃冰。

圖 2 hiPSCs 向 IPCs 分化過程中的形態(tài)變化(放大倍數(shù)：100×)信息學分析 miR-152-3p 的功能富集 DIANATOOLS 數(shù)據庫分析 miR-152-3p 與胰島β細胞分化、凋，如圖 4 所示。

遵義醫(yī)學院碩士學位論文 李蘭蘭圖 2 hiPSCs 向 IPCs 分化過程中的形態(tài)變化(放大倍數(shù)：100×)3.2 生物信息學分析 miR-152-3p 的功能富集通過 DIANATOOLS 數(shù)據庫分析 miR-152-3p 與胰島β細胞分化、凋亡過程及功能相關，如圖 4 所示。
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本文編號：2888254