人工甜味劑,以其高甜度、無能量產(chǎn)生的特性成為各種天然糖類替代品,廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。近年來,愈來愈多的研究表明人工甜味劑能夠破壞血糖耐受性,但具體機制尚不清楚。由α、β、δ等內(nèi)分泌細(xì)胞組成的胰島是動物及人類血糖平衡調(diào)節(jié)的重要器官,胰島內(nèi)分泌細(xì)胞通過釋放如胰島素,胰高血糖素等各類激素,調(diào)節(jié)機體的血糖動態(tài)平衡。甜味受體作為糖類及人工甜味劑感受器,已有部分研究表明甜味受體亞單位T1R2及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白α-gustducin存在于胰島內(nèi)分泌細(xì)胞中,可能介導(dǎo)胰島內(nèi)分泌細(xì)胞激素釋放功能和胰島血糖調(diào)節(jié)功能。但是,對于甜味受體T1R3/T1R2及甜味信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游G蛋白α-gustducin在胰島中的詳細(xì)分布情況,人工甜味劑在胰島內(nèi)分泌細(xì)胞激素釋調(diào)控中的功能尚不清楚。所以,本研究以野生型及甜味受體T1R3基因敲除小鼠為實驗動物模型,利用胰島分離、RT-PCR、免疫組化、HE染色及Elisa、激光共聚焦等實驗技術(shù),明確甜味受體T1R2/T1R3及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白α-gustducin在胰島中的詳細(xì)分布規(guī)律,闡明了人工甜味劑在胰島β細(xì)胞胰島素釋放及葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放中的作用,明確了甜味受體在上述作用的重要作用,另外通過以三氯蔗糖為人工甜味劑代表,分析了人工甜味劑長期暴露后小鼠表型特征、血糖、胰島素釋放及胰島形態(tài)特征變化。具體實驗結(jié)果如下:1.甜味受體在小鼠胰島內(nèi)的表達(dá)與分布規(guī)律RT-PCR及免疫組化結(jié)果表明,胰島特異性表達(dá)甜味受體及甜味信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白α-gustducin;免疫雙標(biāo)結(jié)果表明甜味受體T1R3和T1R2廣泛存在于小鼠胰島α、β和δ細(xì)胞中,而甜味信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白α-gustducin存在于α和δ細(xì)胞中。2.人工甜味劑增效葡萄糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞胰島素釋放靜態(tài)孵育結(jié)合動態(tài)灌注小鼠離體胰島,ELISA分析胰島素釋放,結(jié)果表明人工甜味劑(三氯蔗糖、安賽蜜、糖精)單獨刺激胰島對β細(xì)胞胰島素的釋放無顯著影響,但顯著增效葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放。證明人工甜味劑誘導(dǎo)胰島素釋放的功效嚴(yán)重依賴于葡萄糖的存在。3.甜味受體T1R3的缺失減弱甜味劑協(xié)同葡萄糖誘導(dǎo)β細(xì)胞胰島素釋放作用以甜味受體T1R3基因敲除及同窩野生型小鼠為實驗動物,分離胰島,結(jié)合靜態(tài)胰島孵育和ELISA方法,發(fā)現(xiàn)甜味受體T1R3的缺失雖然對單一人工甜味劑(三氯蔗糖、安賽蜜、糖精)誘導(dǎo)的胰島素分泌無影響,但顯著減弱人工甜味劑協(xié)同葡萄糖誘導(dǎo)胰島素釋放的增效作用。這一結(jié)果揭示了胰島中的甜味受體T1R3在調(diào)控胰島素釋放的通路機制中的重要作用。4.甜味受體T1R3缺失減少胰島細(xì)胞密度及β細(xì)胞數(shù)量以甜味受體T1R3基因敲除及同窩野生型小鼠為實驗動物,冰凍切片與免疫組化方法相結(jié)合,結(jié)果表明與野生型小鼠相比,甜味受體T1R3基因缺失小鼠胰島的數(shù)量、胰島中β細(xì)胞的數(shù)量顯著減少,小鼠胰島面積,胰島α和δ細(xì)胞數(shù)量均有下調(diào)的趨勢,但并沒有明顯差異。結(jié)合甜味受體T1R3基因敲除對人工甜味劑協(xié)同葡萄糖的增效作用影響,說明可能甜味受體T1R3基因敲除可能引發(fā)了小鼠胰島的數(shù)量與胰島中β細(xì)胞的數(shù)量的下降從而減弱了甜味劑誘導(dǎo)的胰島素釋放水平。5.長期三氯蔗糖暴露對小鼠血糖生理生化指標(biāo)、葡萄糖耐受性、頭期胰島素釋放及胰島細(xì)胞密度的影響以三氯蔗糖連續(xù)暴露16周雄性C57BL/6小鼠為實驗對象,暴露過程體重及攝食量跟蹤表明三氯蔗糖攝入對小鼠體重及每日攝食量無顯著影響,但因為三氯蔗糖溶液甜味特性,與對照組相比,顯著增加每日溶液攝入量;暴露過程中血糖耐受實驗表明三氯蔗糖暴露增強小鼠血糖耐受性,這種耐受性可能來自于三氯蔗糖長期暴露過程中,胰島素頭期釋放水平的提高�？傊�,通過上述研究結(jié)果證明了甜味劑增效葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放,揭示了甜味受體T1R3在調(diào)控胰島素釋放的通路機制中的重要作用。而上述研究可能為未來血糖調(diào)控提供一個新的途徑。
【學(xué)位單位】：浙江工商大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TS202.3;R587.1
【部分圖文】：

是動物體內(nèi)最大的消化腺，具有一系列內(nèi)分泌和外分泌（消化）分泌功能來自散布在腺體中的胰島細(xì)胞，通過釋放激素參與體內(nèi)。??腺??外觀呈粉紅色，有明顯的分葉狀光滑表面。胰腺按形態(tài)主要部分，身體和尾部四個部分，其各個部分之間只有非常小的功能或解（如圖１）。胰腺還具有一個附屬葉（鉤突過程），其在解剖學(xué)上和。對成人而言，胰腺的長度在１２到１５厘米之間，其形狀為扁平的，內(nèi)側(cè)末端較厚的部位被稱為胰頭，朝向側(cè)端較薄的部位被叫做分則是胰體。胰體與胰頭的連接處有一個不同的細(xì)長收縮的結(jié)構(gòu)，將其劃分出來稱為胰頸ｍ。胰腺隨著動物年齡的增長，外分泌組，腺體內(nèi)的脂肪結(jié)締組織的量也會減少，這導(dǎo)致胰腺漸進(jìn)性地變薄掃描中尤其明顯。胰腺在動物體內(nèi)的位置處于十二指腸的第一，的曲線內(nèi)，并且橫向地并略微向上延伸穿過后腹壁到胃后面的脾空間不是位于一個平面內(nèi)，而是有效地“覆蓋”在腹膜后和脊柱上【２１。??

浙、；丨：丄商大學(xué)碩Ｉ．：學(xué)位論文???最初由德國生物學(xué)家Ｐａｕｌ?Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ于１８６９發(fā)現(xiàn)｜４１，胰島由至少五種內(nèi)分泌細(xì)??胞類型組成，即ａ細(xì)胞，ｇ細(xì)胞，Ｓ細(xì)胞，ＰＰ細(xì)胞（Ｆ細(xì)胞）和ｅ細(xì)胞，分別??分泌胰高血糖素，胰島素，生長激素抑制素，胰多肽和生長素釋放肽。一般胰島??細(xì)胞結(jié)構(gòu)為Ｐ細(xì)胞優(yōu)先聚集在結(jié)構(gòu)的核心處，而ａ，Ｓ和ＰＰ細(xì)胞在外周排列［５］??（如圖１－２所示）。雖然在所有研究的物種中，Ｐ細(xì)胞最豐富（５０－８０％），其次??是ａ細(xì)胞（２０－５０％?）１＆１，但是在胰島細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)上，物種之間存在顯著差異。??例如，在人類和非人類靈長類動物中，ａ細(xì)胞分散在整個胰島中而不是集中在外??周。Ｐ細(xì)胞的同型相互作用的百分比（與相同類型細(xì)胞相互作用的百分比）在人??胰島中約為２９％，而在小鼠中則為７１％［７】。考慮到內(nèi)分泌胰腺中細(xì)胞間交互的??復(fù)雜性，也許這種結(jié)構(gòu)差異具有功能意義。Ｃａｂｒｅｒａ等Ｗ人的研究表明，對于嚙??齒動物胰島中高葡萄糖濃度的響應(yīng)，膜電位和［Ｃａ２＋］的振蕩是協(xié)調(diào)的，因此整個??胰島顯示出同步振蕩響應(yīng)。在人類胰島中沒有發(fā)生這種情況，這些反應(yīng)不同步。??此類發(fā)現(xiàn)表明細(xì)胞分布模式（聚集與散射）和胰島細(xì)胞功能之間存在相關(guān)性。胰??島富含血管，以確保內(nèi)分泌細(xì)胞有效地分泌激素進(jìn)入血液。有研究顯示，與周圍??的外分泌組織相比，胰島內(nèi)血管的內(nèi)部容積和微血管表面積增加了近兩倍［９】。??

—＞?定位??？免疫熒光雙標(biāo)法??圖２－１本章實驗技術(shù)路線??Ｆｉｇ．２－１?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ?ｏｆ?ｔｈｉｓ?ｃｈａｐｔｅｒ??２．３．２小鼠胰島的分離??小鼠斷頸致死后，酒精消毒小鼠腹部，小鼠腹腔打開，小鼠胰腺部位清洗可??見，隨后將小鼠置于解剖鏡下，用微型止血鉗夾住十二指腸與總膽管交接的壺腹??處，用注射器（５ｍｌ，針頭型號為３０Ｇ）從總膽管處逆行插入，將３ｍｌ膠原蛋白??酶ＸＩ消化液緩慢注入胰腺內(nèi)，如示意圖３－２所示，使胰腺組織均勻膨脹�？焖僬�??除胰腺放入２ｍｌ消化液的５０ｍｌ離心管中。將５０ｍｌ離心管放置３７．５°Ｃ的水浴鍋??孵育１８ｍｉｎ?（若穿刺總膽管不順利，胰腺膨脹不佳則需要適當(dāng)增加孵育時間）。??在孵育過程中搖晃離心管２到３次。孵育完成后，搖晃離心管以分解胰腺直至懸??浮物變得均勻。將離心管放置于冰上并加入含１０％胎牛血清的ＨＢＳＳ緩沖液至??２０ｍｌ以終止消化。離心（２９０ｇ，３０ｓ，４°Ｃ），去除上清液。然后加入２０ｍｌ冷的含??１０％胎牛血清的ＨＢＳＳ緩沖液
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本文編號：2887870