發(fā)布時間：2020-11-14 04:29

　　 目的:本實(shí)驗(yàn)通過維甲酸干預(yù)來誘導(dǎo)大鼠的骨質(zhì)疏松(Osteoporosis,OP)模型,觀察研究模型大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)與正常大鼠BMSCs成骨能力的差異,檢測酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)在兩組BMSCs中的動態(tài)表達(dá),并通過RNA干擾技術(shù)(RNAi)降低骨質(zhì)疏松BMSCs中CKIP-1的表達(dá),探索CKIP-1在調(diào)控骨質(zhì)疏松BMSCs成骨能力的作用,為靶向基因治療骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損提供分子學(xué)理論依據(jù)。方法:(1)大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立與驗(yàn)證:取12周齡SD大鼠20只,隨機(jī)分為兩組,骨質(zhì)疏松組利用維甲酸灌胃法,快速建立骨質(zhì)疏松模型,正常組灌以等體積生理鹽水。灌胃兩周后骨密度儀檢測兩組大鼠骨密度值(Bone Mineral Density,BMD);處死大鼠,取兩組大鼠雙側(cè)股骨近骺端骨組織,進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin stainng,HE),鏡下觀察兩組大鼠骨小梁變化,驗(yàn)證骨質(zhì)疏松模型建立成功。(2)BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定:分離兩組大鼠四肢,沖出骨髓,采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)兩組大鼠BMSCs,加入2ml 20%DMEM/F12培養(yǎng)液,置于37~0C、5%CO_2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),觀察原代細(xì)胞形態(tài),取P3代細(xì)胞進(jìn)行姬姆薩染色;選擇對數(shù)生長期細(xì)胞完成細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)并且繪制生長曲線,觀察兩組大鼠BMSCs增殖能力的差異;流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組BMSCs表面標(biāo)志物CD90、CD44、CD34,對兩組BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色,觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況;成脂誘導(dǎo)28 d后油紅“O”染色并進(jìn)行油紅“O”吸光度(OD)值半定量測定,觀察脂滴形成情況,證明BMSCs的多向分化潛能。(3)正常和骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs成骨能力的對比研究:對正常和骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo),誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色比較兩組BMSCs鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量和大小;誘導(dǎo)14 d后堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色,誘導(dǎo)7 d和14 d酶標(biāo)儀檢測ALP活力,比較兩組BMSCs的ALP分泌情況;兩組BMSCs成骨誘導(dǎo)0、3、7、10、14 d,RT-PCR檢測CKIP-1的動態(tài)表達(dá);成骨誘導(dǎo)10 d后RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表達(dá)差異。(4)沉默CKIP-1基因?qū)琴|(zhì)疏松大鼠BMSCs成骨能力的影響:使用RNAi技術(shù)下調(diào)骨質(zhì)疏松BMSCs中CKIP-1的表達(dá),設(shè)骨質(zhì)疏松+空載組(OP+negative control,OP+NC),骨質(zhì)疏松+沉默組(OP+CKIP-1~-),正常+空載組(Normal+NC),慢病毒轉(zhuǎn)染72 h鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,RT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率;轉(zhuǎn)染后選擇對數(shù)生長期細(xì)胞完成細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn);取轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo),誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色,大體及鏡下觀察轉(zhuǎn)染后三組BMSCs鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量和大小;誘導(dǎo)14 d后ALP染色,誘導(dǎo)14 d酶標(biāo)儀檢測ALP活力,比較轉(zhuǎn)染后三組BMSCs的ALP分泌情況;成骨誘導(dǎo)10 d后RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因OPN、Runx的表達(dá)情況。結(jié)果:(1)成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型:骨密度結(jié)果顯示正常組為0.46±0.06 g/cm~2,骨質(zhì)疏松組骨密度值為0.41±0.03 g/cm~2,骨質(zhì)疏松大鼠骨密度值明顯低于正常組(P﹤0.05);大鼠雙側(cè)股骨近骺端骨組織HE染色結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松組骨量明顯少于正常組。(2)BMSCs的成功分離培養(yǎng)及鑒定:全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)兩組BMSCs第5 d,細(xì)胞多呈星型,多角型,細(xì)胞集落樣生長,P3代細(xì)胞姬姆薩染色顯示細(xì)胞呈短梭形為主;細(xì)胞增殖速度快,前7 d兩組細(xì)胞增殖能力無明顯差異,第9 d時骨質(zhì)疏松組增殖能力強(qiáng)于正常組(P﹤0.05),兩組BMSCs均陽性表達(dá)CD90與CD44,陰性表達(dá)CD34;成骨和成脂誘導(dǎo)后均見鈣結(jié)節(jié)和脂滴形成,油紅“O”的OD值骨質(zhì)疏松組高于正常組(P﹤0.05)。(3)骨質(zhì)疏松組BMSCs成骨能力檢測結(jié)果:成骨誘導(dǎo)21 d,與正常組相比,骨質(zhì)疏松組BMSCs鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量少,面積小;成骨誘導(dǎo)14 d,正常組ALP染色塊狀深染顆粒比骨質(zhì)疏松組多,染色深,ALP活力亦強(qiáng)于骨質(zhì)疏松組(P﹤0.05);CKIP-1動態(tài)表達(dá)結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松組BMSCs CKIP-1表達(dá)水平總體高于正常組;成骨誘導(dǎo)10 d,骨質(zhì)疏松組BMSCs成骨相關(guān)基因OPN,Runx2的mRNA相關(guān)水平均低于正常組(P﹤0.05)。(4)沉默CKIP-1基因后骨質(zhì)疏松+沉默組BMSCs成骨能力檢測結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)染后,骨質(zhì)疏松+沉默組CKIP-1的mRNA表達(dá)量明顯低于骨質(zhì)疏松+空載組(P﹤0.05);由生長曲線看出慢病毒對細(xì)胞增殖能力無明顯影響;成骨誘導(dǎo)21 d,骨質(zhì)疏松+沉默組和正常+空載組鈣結(jié)節(jié)形成比骨質(zhì)疏松+空載組數(shù)量多,面積大,ALP染色和ALP活力檢測均支持這一結(jié)果;成骨誘導(dǎo)10 d,與骨質(zhì)疏松+空載組相比,骨質(zhì)疏松+沉默組的成骨相關(guān)基因OPN,Runx2顯著性增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但仍低于正常+空載組。結(jié)論:(1)維甲酸誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型BMSCs較正常組增殖能力增強(qiáng),成骨能力降低,成脂能力升高。(2)沉默CKIP-1基因可以部分提高骨質(zhì)疏松BMSCs的成骨分化能力。
【學(xué)位單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R580
【部分圖文】：

圖 1-2 大鼠股骨干骺端骨組織 HE 染色(AB×40，CD×100)：A.C：正常組；B.D：骨質(zhì)疏松組.Fig. 1-2 HE staining of the rat femoral metaphysis (AB×40,CD×100):A.C: the normal group; B.D: thosteoporosis group1.3 討論經(jīng)典的去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過切除雙側(cè)卵巢，引起雌激素水下降，從而影響骨改建平衡過程，破骨細(xì)胞增加的同時成骨細(xì)胞形成減少造成嚴(yán)重的骨量丟失，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生；但該模型構(gòu)建 3 個月才能得到穩(wěn)定的骨質(zhì)疏松模型，造模時間長[30]。目前，維甲酸是惡性腫和白血病的有效治療的藥物，但其在治療過程中有一個不良反應(yīng)，就是造成急性骨質(zhì)疏松的發(fā)生，與糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松模型類似，全給予維甲酸會引起全身的骨骼骨量丟失，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。維甲酸干

CKIP-1 調(diào)控骨質(zhì)疏松大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的研究 2019 碩士學(xué)位論文2.2 結(jié)果分析2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（原代和傳代培養(yǎng)）正常組和骨質(zhì)疏松組 BMSCs 原代培養(yǎng)第 5 d，鏡下觀察細(xì)胞多呈星型多角型，細(xì)胞集落樣生長，見圖 2-1A 和 2-1B，之后細(xì)胞繼續(xù)生長，約 13即可匯合成80%；傳3代BMSCs姬姆薩染色顯示對照組細(xì)胞呈短梭形為主排列成漩渦狀和放射狀，見圖 2-1C；骨質(zhì)疏松組姬姆薩染色結(jié)果顯示細(xì)胞形態(tài)與正常組基本一致，見圖 2-1D。

圖 2-3 正常組和骨質(zhì)疏松組 BMSCs 表面抗原表達(dá)Fig. 2-3 Surface antigens expression of BMSCs in the normal group and the osteoporosis group2.2.4 BMSCs 多向分化結(jié)果2.2.4.1 成骨誘導(dǎo)分化BMSCs 成骨誘導(dǎo) 21 d 后，細(xì)胞呈鋪石路樣生長，間質(zhì)間見鈣鹽沉積形成鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色后鈣結(jié)節(jié)呈橘紅色；正常組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量多，見圖 2-4A，骨質(zhì)疏松組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量少，見圖 2-4B。
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本文編號：2883077