目的2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的主要發(fā)病機(jī)制是胰島素抵抗(IR)和胰島β細(xì)胞功能衰竭。胰島組織分泌的胰島素,作為人體唯一降糖激素,在T2DM的發(fā)生發(fā)展中起舉足輕重的作用,目前對(duì)胰島組織及其核心細(xì)胞胰島β細(xì)胞的病理生理機(jī)制了解甚少,尚無(wú)統(tǒng)一定論。細(xì)胞焦亡作為一種新型炎癥性細(xì)胞死亡,近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)廣泛參與多種急慢性炎性損傷過(guò)程,成為探索疾病機(jī)理、尋找治療靶點(diǎn)的重要方向。本研究設(shè)計(jì)基于以下兩點(diǎn),一方面,糖脂毒性貫穿T2DM發(fā)病始末環(huán)節(jié),脂多糖(LPS)是病原菌附屬產(chǎn)物,作為腸道菌群失調(diào)后效應(yīng)與T2DM之間存在密切關(guān)聯(lián),既往研究表明高糖、高脂、LPS可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)糖尿病相關(guān)疾病的組織細(xì)胞發(fā)生焦亡損傷,但無(wú)研究證實(shí)在2型糖尿病的胰島β細(xì)胞中是否發(fā)生焦亡現(xiàn)象。另一方面,利拉魯肽(liraglutide)作為一種新型降糖藥物胰高血糖素樣肽-1受體激動(dòng)劑(GLP-1RA),近期研究發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)單核巨噬細(xì)胞中含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3(NLRP3)炎性小體相關(guān)的細(xì)胞焦亡具有抑制作用,目前雖無(wú)GLP-1RA對(duì)T2DM胰島β細(xì)胞的抗焦亡相關(guān)研究出現(xiàn),但無(wú)疑,降糖藥物GLP-1RA表現(xiàn)出巨大的抗焦亡潛力。基于上述背景,本研究旨在探索以下四個(gè)問(wèn)題:1)高糖、高脂、LPS是否引起胰島β細(xì)胞發(fā)生NLRP3依賴(lài)的細(xì)胞焦亡及其分子機(jī)制;2)焦亡損傷是否影響胰島細(xì)胞的胰島素分泌功能;3)進(jìn)一步探索GLP-1RA利拉魯肽是否具有抑制胰島β細(xì)胞焦亡的作用;4)利拉魯肽是否對(duì)焦亡損傷后胰島細(xì)胞的分泌功能有所改善。本研究為T(mén)2DM胰島β細(xì)胞的病理機(jī)制拓寬認(rèn)知領(lǐng)域,為利拉魯肽的臨床應(yīng)用增添新證據(jù)。方法1.分別探索葡萄糖、軟脂酸(PA)、LPS誘導(dǎo)胰島βTC-6細(xì)胞構(gòu)建焦亡模型的最佳條件。用不同濃度、不同時(shí)長(zhǎng)的葡萄糖和PA,用單一或聯(lián)合三磷酸腺苷(ATP)的LPS分別處理胰島βTC-6細(xì)胞,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)、Western Blot法檢測(cè)胰島β細(xì)胞中NLRP3、半胱天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)的表達(dá)水平,對(duì)經(jīng)干預(yù)后的β細(xì)胞進(jìn)行高糖刺激下胰島素分泌試驗(yàn)(GSIS),后續(xù)用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中胰島素分泌量,探討以上三種干預(yù)方式對(duì)胰島β細(xì)胞的焦亡誘導(dǎo)情況,及焦亡發(fā)生對(duì)β細(xì)胞的胰島素分泌損傷情況。2.根據(jù)第一部分結(jié)果提示,分別用最佳誘導(dǎo)條件的葡萄糖、PA、LPS三種因素誘導(dǎo)胰島βTC-6細(xì)胞發(fā)生焦亡,并給予利拉魯肽和caspase-1抑制劑處理,用FITC-Annexin V/PI細(xì)胞雙染凋亡試劑盒行細(xì)胞染色后用流式細(xì)胞術(shù)分析,了解焦亡細(xì)胞比例,用RT-PCR法、Western Blot法檢測(cè)NLRP3、caspase-1、GSDMD焦亡表達(dá)情況,進(jìn)行GSIS實(shí)驗(yàn)后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液胰島素分泌量,探討利拉魯肽對(duì)葡萄糖、PA、LPS誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞焦亡的抑制作用及其對(duì)胰島功能的保護(hù)作用。結(jié)果1.不同條件的葡萄糖、PA、LPS處理可誘導(dǎo)胰島βTC-6細(xì)胞發(fā)生不同程度的NLRP3、caspase-1相關(guān)焦亡表達(dá),且胰島β細(xì)胞不同程度的焦亡發(fā)生伴隨著不同程度的細(xì)胞胰島素分泌功能的下降。2.葡萄糖、PA、LPS處理后的胰島βTC-6細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)焦亡細(xì)胞百分比增加,細(xì)胞中NLRP3、caspase-1和GSDMD蛋白和mRNA表達(dá)量增加,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中胰島素含量減少。使用利拉魯肽和caspase-1抑制劑后,其流式細(xì)胞術(shù)分析得出的焦亡細(xì)胞百分比明顯下降,細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD的表達(dá)水平降低,并且用ELISA法檢測(cè)的細(xì)胞上清液胰島素分泌量有所上升。結(jié)論1.高糖、高脂、LPS可以誘導(dǎo)胰島βTC-6細(xì)胞發(fā)生NLRP3依賴(lài)的細(xì)胞焦亡,并且損傷胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能。2.利拉魯肽能夠抑制高糖、高脂、LPS誘導(dǎo)的胰島βTC-6細(xì)胞NLRP3依賴(lài)的細(xì)胞焦亡,并且改善細(xì)胞焦亡對(duì)胰島功能的損傷。
【學(xué)位單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R587.1
【部分圖文】：

評(píng)估焦亡發(fā)生并尋找最佳濃度、時(shí)間點(diǎn)。給予βTC-6 細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)、濃度梯度的葡萄糖干預(yù)，通過(guò) RT-PCR 方法測(cè)量各組焦亡相關(guān)基因 NLRP3、caspase-1mRNA 的表達(dá)差異。用不同濃度梯度的葡萄糖，干預(yù)胰島細(xì)胞 24h，結(jié)果顯示，隨葡萄糖刺激濃度的增加，焦亡現(xiàn)象越明顯。如圖 1-1a 所示，在葡萄糖 5g/L 的誘導(dǎo)濃度下，NLRP3的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量高于其他濃度組，與對(duì)照組相比，P﹤0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在圖 1-1b 中，葡萄糖 5g/L、10g/L 兩組 caspase-1 的 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組對(duì)比，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，雖 10g/L 濃度組的 caspase-1 的 mRNA 表達(dá)量更大，但與5g/L 組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用不同濃度梯度的葡萄糖，干預(yù)胰島細(xì)胞 48h 后，NLRP3、caspase-1 的 mRNA表達(dá)變化情況和干預(yù) 24 小時(shí)后的結(jié)果相同（見(jiàn)圖 1-2）。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)綜合判斷，我們初步認(rèn)為，5g/L 的葡萄糖是誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生焦亡的最佳濃度點(diǎn)。

圖 1-2 濃度梯度葡萄糖刺激 48h，胰島細(xì)胞 NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達(dá)情況Fig.1-2 The mRNAexpression of NLRP3 and caspase-1 in islet cells induced by glucose for48h with different concentration注：給予βTC-6 細(xì)胞不同濃度的葡萄糖干預(yù)，檢測(cè)干預(yù) 24h 后 NLRP3、caspase-1 的 mRNA 表達(dá)情況（圖 1-1）和 48h 后 NLRP3、caspase-1 的 mRNA 表達(dá)情況（圖 1-2），與對(duì)照組相比*P﹤0.05；ns 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.1.2 不同時(shí)長(zhǎng)高糖刺激下 NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達(dá)情況根據(jù)前文結(jié)果，在葡萄糖的最佳誘導(dǎo)濃度 5g/L 基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索最佳作用時(shí)間點(diǎn)，以 RT-PCR 檢測(cè) NLRP3、caspase-1 的 mRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 24h 組對(duì)比48h 組 NLRP3 的 mRNA 表達(dá)量更高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如 1-3a），48h 組的 caspase-1 mRNA 表達(dá)量也較 24h 組增加，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖1-3b）。通過(guò) RT-PCR 方法評(píng)估，我們的初步結(jié)論為 48h 是葡萄糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生焦亡的最佳時(shí)間點(diǎn)。

48h 組的 caspase-1 mRNA 表達(dá)量也較 24h 組增加，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（如圖1-3b）。通過(guò) RT-PCR 方法評(píng)估，我們的初步結(jié)論為 48h 是葡萄糖誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生焦亡的最佳時(shí)間點(diǎn)。圖 1-3 不同時(shí)長(zhǎng)葡萄糖刺激，胰島細(xì)胞 NLRP3、caspase-1 mRNA 的表達(dá)情況Fig.1-3 The mRNAexpression of NLRP3 and caspase-1 in islet cells induced by glucose fordifferent duration
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 丁月霞;李真;任瑞珍;趙圣文;;利拉魯肽的文獻(xiàn)計(jì)量學(xué)分析[J];藥物流行病學(xué)雜志;2016年11期

2 史瓊枝;李銀科;陳晨;廖翔茹;謝向陽(yáng);;利拉魯肽對(duì)缺氧和高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響[J];武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2017年02期

3 李婷;黃幀檜;孫淑萍;;利拉魯肽對(duì)高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響[J];通化師范學(xué)院學(xué)報(bào);2017年08期

4 包利文;武革;;利拉魯肽治療肥胖研究進(jìn)展[J];海南醫(yī)學(xué);2016年09期

5 黃嘉;王俊;;利拉魯肽專(zhuān)利技術(shù)構(gòu)成及發(fā)展[J];科技導(dǎo)報(bào);2016年11期

6 陳向芳;劉志民;;新型降糖藥利拉魯肽注射液(Ⅰ)[J];藥學(xué)服務(wù)與研究;2015年01期

7 牛世偉;武俊紫;李曉波;王文林;李燕;李樹(shù)德;;利拉魯肽調(diào)控高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝病的分子機(jī)制[J];解剖學(xué)報(bào);2014年06期

8 格桑達(dá)娃;;冬季,去看拉魯濕地[J];知識(shí)就是力量;2017年02期

9 王淑芳;于蘇國(guó);;利拉魯肽治療肥胖2型糖尿病合并H型高血壓的療效觀(guān)察[J];健康之路;2016年10期

10 黃紹航;孫菊英;;魯拉魯先生[J];紅蜻蜓;2017年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李永梅;利拉魯肽在脂肪細(xì)胞分化及白色脂肪棕色樣變中的作用機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2018年

2 李娜娜;肥胖對(duì)肝細(xì)胞和內(nèi)皮功能的影響及利拉魯肽改善內(nèi)皮功能紊亂的分子機(jī)制[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

3 王志敏;GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽在心臟慢性移植排斥反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2018年

4 蔡歡;有氧間歇訓(xùn)練配合利拉魯肽對(duì)糖尿病心肌病大鼠降糖護(hù)心作用的效果和機(jī)制研究[D];河北師范大學(xué);2019年

5 李爭(zhēng)明;利拉魯肽對(duì)AC3/cAMP/PKA/HSL脂肪代謝通路的影響及AC3與胰島素抵抗的關(guān)系[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2017年

6 吳學(xué)倫;利拉魯肽對(duì)體外成骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡影響及其作用機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

7 孔飛娟;利拉魯肽對(duì)糖尿病小鼠認(rèn)知功能下降的作用及其分子機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2017年

8 白蓮;利拉魯肽對(duì)2型糖尿病非酒精性脂肪肝的作用及機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2014年

9 陽(yáng)柳雪;利拉魯肽對(duì)Ⅲ型腺苷酸環(huán)化酶表達(dá)的影響及其在胰島素抵抗和肥胖中的作用[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2013年

10 張楠;利拉魯肽對(duì)肥胖超重2型糖尿病患者脂代謝、骨代謝以及炎癥因子的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 駱云晨;利拉魯肽通過(guò)炎癥信號(hào)通路改善糖尿病小鼠非酒精性脂肪肝的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

2 施寧華;利拉魯肽對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];遵義醫(yī)科大學(xué);2019年

3 陳麗帆;利拉魯肽抑制NLRP3依賴(lài)的糖尿病胰島βTC-6細(xì)胞功能損傷的焦亡機(jī)制研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2019年

4 郭晶晶;利拉魯肽對(duì)動(dòng)脈硬化大鼠模型臨床療效評(píng)價(jià)和作用機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

5 劉昇;GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽對(duì)2型糖尿病大鼠腎臟組織保護(hù)機(jī)制的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2018年

6 黎起云;利拉魯肽對(duì)PCI術(shù)后患者血清致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)的保護(hù)作用及其機(jī)制[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

7 王愛(ài)媚;利拉魯肽對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

8 吳東霞;利拉魯肽對(duì)非酒精性脂肪肝的作用及FGF21、FoxA2表達(dá)的影響[D];湖南師范大學(xué);2018年

9 劉心苑;門(mén)冬胰島素30治療血糖控制不佳的超重或肥胖2型糖尿病患者加用利拉魯肽的臨床療效[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

10 齊魯鈺;利拉魯肽對(duì)肥胖2型糖尿病患者的臨床療效研究[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2018年

本文編號(hào)：2880491